新生小鼠侧脑室下区电穿孔技术

本实验的目的是对脑室下区神经干细胞的分子组分进行遗传标记和操控。首先将装有DNA的玻璃移液管插入出生后第零天（P zero）小鼠的侧脑室，实现DNA递送。第二步是将DNA注入侧脑室的脑脊液中。随后对小鼠施加电流，从而使DNA转移至侧脑室壁上的神经干细胞内。

最终，通过结合多种分子技术，包括免疫组织化学、分子生物学、显微镜技术以及电生理学，来观察脑室下区神经干细胞在命运决定、增殖、迁移和成熟过程中的变化。新生儿脑室下区电穿孔技术有助于回答神经发生领域中的关键科学问题，例如哪些分子通路负责调控神经干细胞及其子代细胞的增殖、分化、迁移和成熟。与现有的转基因小鼠等方法相比，该技术的主要优势在于能够以高效、经济的方式快速且高效地标记脑室下区（SVZ）的神经干细胞。

首先，确保用于电穿孔的 DNA 具有高纯度和高浓度，并且不含内毒素。将 10 厘米长的火焰抛光 BO 二氧化硅玻璃毛细管拉制成移液管。此处使用 PP eight 30 ghhi PC 10 型移液管拉制仪，设置为在 70.5 °C 下进行一步加权拉制。拉制完成后，使用环形镊子折断尖端。

然后在解剖显微镜下检查移液管，确保无锯齿状边缘。如有需要，可使用磨石对尖端进行斜面处理。接着将制备好的移液管置于紫外灯下照射15分钟。

15分钟结束后，用细头记号笔在移液器尖端边缘向上2毫米处做标记。最后，通过将无菌过滤的0.9%无菌生理盐水与干燥的快绿染料混合，配制0.1%（重量/体积）的快绿溶液。取出生0至1天的幼鼠，将其置于预先冷却至4摄氏度并放置在冰上的玻璃培养皿中。约5分钟后，通过脚趾夹捏反应判断麻醉状态。

若未观察到任何运动，则开始心室内注射。将快绿溶液与DNA溶液混合，并取一到两微升分装至生物膜上。此步骤需在注射前立即进行，因为快绿溶液与DNA混合后可能导致迅速蒸发和结晶，进而堵塞玻璃移液管。用微量移液器吸取全部分装体积，并将玻璃移液管装入气压注射仪中。

现在，用非优势手的拇指和食指轻轻夹住幼鼠的头部并固定。然后打开光源，将幼鼠头部置于光束外侧。若脑室不清晰可见，可用无菌生理盐水润湿头部，以减少头皮反射的光线。

接下来，使用惯用手将针头插入同侧侧脑室。注射部位应大致位于枕额缝与眼睛之间等距处，并在矢状缝外侧约2毫米处。将拉制的移液管插入至2毫米刻度处，直至出现P0爆破感，以确保进入侧脑室。

由于颅内压释放，可能会发生脑脊液回流至移液管内。若出现此情况，可松开对POP头部的握持以降低压力，从而辅助质粒的注射。当移液管达到最佳插入位置后，向侧脑室注射约0.5 µL质粒。

将电穿孔仪的电压设置为 100 伏，施加五个方波脉冲，每个脉冲持续 50 毫秒，脉冲间隔为 50 毫秒。等离子体电穿孔的空间特异性由电荷转移的方向决定，因此在电极放置时需考虑空间布局，因为侧脑室下区（SVZ）的细胞类型具有高度多样性。已有研究报道，在腹侧至尾状核（CAU）区域，细胞命运和增殖能力均发生了变化。

注射质粒后，将镊子电极浸入PBS中，以最大化电荷转移并有助于防止因电阻引起的灼伤。接着，将正极电极置于靠近耳部的颅骨背外侧壁，并将电极侧向浸入细胞质进行注射。然后，将负极电极置于对侧半球吻部腹外侧。

该图显示了注射后幼鼠上负极和正极相对于 x、y、z 轴的正确方位。通过踩下脉冲脚踏开关启动电流传递，并以约 25 度的角度间隔将电极从背侧扫向侧方。电穿孔完成后，将所有经过电穿孔处理的幼鼠置于加热垫上五分钟。

每30秒轻轻旋转幼鼠并给予轻度刺激。该图像显示新生小鼠在转染编码EGFP的载体并进行电穿孔后24小时的侧脑室。经电穿孔的细胞呈现绿色荧光。

在此图中，我们看到在将 Cre 重组酶和编码 GFP 的质粒电穿孔转入携带上游 TD Tomato 终止序列的小鼠体内 28 天后，侧脑室（LV）被标记。重组诱导了红色所示的 TD Tomato 表达；由于质粒的连续稀释，少数残留的 SVZ 细胞呈 EGFP 阳性，而基因组表达的 TD Tomato 则持续稳定表达。质粒 DNA（绿色所示）的稀释效应明显，因为在嗅球颗粒层（OB）中标记的细胞更多表达了基因组标记物 TD Tomato（红色所示）。观看本视频后，您应能充分理解如何对 SVZ 来源的干细胞进行标记与操作。