同时记录突触前与突触后电生理信号 非洲爪蟾 神经-肌肉共培养

本实验的总体目标是从非洲爪蟾胚胎中获得突触连接的脊髓神经元和肌细胞的原代培养物。首先通过向雄性和雌性非洲爪蟾注射人绒毛膜促性腺激素以诱导其繁殖，并收集受精卵。第二步是去除22期胚胎的胶状膜、卵黄和膜结构。

接下来，从胚胎中分离脊髓神经元和肌肉，并去除皮肤后弃去。最后一步是将分离的细胞接种到培养皿中，使其形成有功能的神经肌肉接头。最终，可通过在培养的神经元和肌细胞上同时进行成对膜片钳记录，来验证功能性突触连接的存在。

该技术的优点在于能够获得易于获取的脊椎动物突触标本。它可用于通过突触后电生理记录来监测神经递质释放，同时测量突触前离子活动。此外，该方法清晰且简便，仅需解剖显微镜等常规设备，因此培养物可在室温下的简单培养基中保存。

该制备方法可用于解答突触生理学领域的关键问题，包括突触前的生化和生物物理事件如何与神经递质释放相偶联。此外，该方法也适用于神经调制、突触形成以及突触可塑性的研究。开始此操作前，根据随附的手稿配制所需的溶液。然后，通过将微型针固定在玻璃巴斯德移液管末端，制备至少两个显微解剖工具。

使用Sano丙烯酸胶水，使大头针的尖端从移液管末端伸出约0.5厘米。在准备培养物前两天，通过观察雌性个体明显的红褐色螯爪aika以及雄性前肢掌面的深色色素沉着，确定一对已具备繁殖能力的XUS个体。随后用网分别捞出每只蛙，并用网将其腹部朝下固定在水槽中，使其能够自由逃脱。

通过网具将一毫升HCG注射到其中一个背部淋巴囊中，进行皮下注射，以确保动物不会踩踏新产下并已受精的卵。在水箱底部安装带有筛网的底板，网眼尺寸为半英寸，距底部一至两英寸。然后将一对亲本放入一个带盖的10加仑水箱中进行繁殖。

将青蛙静置 12 至 48 小时，直至观察到受精卵出现在筛网下方的缸底。随后将动物从缸中移出，但至少再静置卵至少 24 小时不加干扰。这对青蛙可在六周后再次进行繁殖。

接下来，将胚胎从培养皿底部松动，并转移至四到五个60 mm × 15 mm的培养皿中，每个培养皿内含10%生理盐水。根据Nieuwkoop与Faber的分期方案对胚胎进行筛选：外观光滑、具有浅棕色和白色斑纹的胚胎（如左侧所示）最为理想。而具有较大黑色或白色斑块的胚胎（如右侧所示）通常不健康，不可使用。

在超净工作台内，将约360个直径15毫米的无菌培养皿用10%生理盐水标记并装填至半满，另取一个培养皿装入CMF溶液。使用无菌玻璃巴斯德移液管，在超净工作台内的体视变倍解剖显微镜下，将5至10个处于22至24期的胚胎转移至其中一个含有10%生理盐水的培养皿中，用两对无菌镊子逐个去除每个胚胎的胶质包膜和外层膜。通过依次将裸露的胚胎逐个移过另外两皿10%生理盐水进行洗涤，最后将其转移至含有CMF的培养皿中。

接下来，用镊子轻轻但牢固地夹住每个胚胎，使用显微解剖工具去除位于动物体背侧最上方的神经管及其相关的体节肌。通过进行三处切口来完成此操作：两处分别位于神经管的两端，第三处位于神经管腹侧稍下方。然后将每一段解剖出的带有体节肌的神经管移至培养皿中干净的区域，远离卵黄颗粒和其他碎片。

在CMF中放置约15分钟后，用镊子将色素化的皮肤从解剖组织上提起并丢弃。再经过额外30至60分钟，细胞将相互分离，形成类似沙堆的形态。在此步骤中，将一支10毫升的培养基解冻，随后加入70微升ITS，浓度为35纳克/毫升，BDNF标记，并用L-15培养基将35毫米无菌培养皿填充至约一半容量。

每个解剖好的胚胎使用一个培养皿。制作接种用移液管时，用手握住玻璃巴斯德移液管的两端，将尖端部分置于火焰上加热，然后将两端拉开至约10厘米长。

随后折断末端，使尖端直径约为 0.2 毫米。然后使用涂布毛细管从一个胚胎中吸取沙堆。注意尽量减少吸入的溶液量。

接下来，将细胞排出并沉积到培养皿底部，以多条线状形式进行接种。随后，将接种了细胞的培养皿静置至少15分钟，以使细胞有足够时间贴附于培养皿表面。接种后的细胞在培养12至24小时后，将呈现出明显的形态学特征。

例如，肌肉细胞会变为纺锤形，脊髓神经元则会发育出较长的突起。通过同步的成对电生理记录，可以确认尿酸、曲张体与肌肉细胞之间形成的功能性突触联系。为此，需准备两个用于记录的膜片电极，一个用于记录突触前曲张体，另一个用于记录肌肉细胞。

然后用含有信息素的溶液填充突触前电极，用钾内液填充突触后电极。接着，将培养皿中的培养基更换为NFR。随后将其转移至配备相差光学系统的倒置显微镜下，用含两性霉素的电极封接突触前膨体，用另一电极封接突触后肌细胞，以确认突触的功能性；使用膜片钳放大器去极化膨体，并同时观察突触前和突触后的电流反应。

该图显示了细胞接种后立即观察到的5倍放大视野下的细胞和培养物，以及同一培养物在40倍放大下的图像。此处为培养中的神经肌肉接头，显示了神经元胞体、突触前末端、曲张体以及突触后肌细胞。图中所示为突触前和突触后电流。

当对突触前曲张体施加从 -30 毫伏至 +40 毫伏、每步 10 毫伏的递增电压刺激时，两个细胞的钳制电位均为 -70 毫伏。掌握该技术后，实验可在约两小时内完成。可在24小时内获得可存活的细胞培养物，并可维持数天。该制备方法已应用多年，有助于阐明神经肌肉传递的一些基本特性。

我们希望本视频能够帮助研究人员更加熟悉这种强大而简便的技术，从而推动探索的持续进行。