分离具有降解农业用可生物降解塑料地膜潜力的天然土壤微生物

以下实验的总体目标是分离出定殖并降解可生物降解地膜的土壤真菌和细菌。首先将可生物降解地膜装入网袋后埋入土壤中进行孵育，孵育时间需足够长，以允许本地土壤微生物大量定殖。孵育结束后，取出地膜并进行梯度稀释涂布培养，从而获得每种可培养微生物的单一分离菌落。

然后将分离得到的微生物接种到新的表面、已消毒的可生物降解地膜上，以及含有或不含碳源的琼脂平板上。为了比较生长情况，还需在液体培养基中验证结果。结果显示，某些分离菌株能够定殖和/或降解材料，可通过扫描电子显微镜观察，并经凝胶渗透色谱法进一步验证。

请注意，处理未鉴定的真菌和细菌分离物可能存在危险，因此在进行本实验操作时应始终采取预防措施，例如佩戴手套、密封培养管和培养皿，并在生物安全柜中操作。在将覆盖物碎片置于土壤中孵育，并根据文本方案制备培养基和试剂后，将新的覆盖物碎片切割成 4.25 厘米的正方形，以对覆盖物碎片进行去污处理。如果灭菌不会改变或降解材料，则对这些覆盖物碎片进行高压灭菌；对于不可高压灭菌的覆盖物碎片（如塑料制成的碎片），则不进行高压灭菌。

根据文本方案准备好生物安全柜后，将覆盖物碎片成排放置于已去污染的罩内，使用洁净的灭菌镊子，从最前排开始并向后排依次操作，避免手和手臂跨越已去污染的表面，将覆盖物碎片在紫外光下孵育两小时。翻转覆盖物碎片，使已除害的一侧朝下放置于洁净区域，暴露在紫外光下，但该区域此前未与覆盖物接触过。每侧均进行两小时紫外处理后，再次从前排至后排依次操作。

使用无菌镊子将覆盖物碎片从生物安全柜中取出，并放入无菌干燥的带盖容器中，例如用铝箔覆盖的烧杯。将其在室温、避光条件下存放于无菌转移罩下。采用无菌操作技术，将经紫外线消毒处理的覆盖物碎片放置于琼脂平板表面，先放下其中一个角，再轻柔地让其余部分自然展开并与琼脂表面接触。

对于非透水性薄膜，将四滴各10微升的熔融半固体最小培养基分别置于覆盖物碎片的四个角上，以提供水分和营养，促进疏水性塑料的初始定殖。操作时不要触碰覆盖物碎片的表面。使用移液枪头时，液滴将固化成珠状。

将盖好的培养皿直立于室温下孵育过夜，使其凝固。随后将培养皿倒置（琼脂面朝上），避光保存于4°C环境中。生物测定所需的所有材料现已准备就绪，可开始从埋入土壤中的覆盖物碎片中分离潜在的降解真菌。

从土壤中挖出网袋，并将覆盖物碎片从网袋中取出。使用无菌刮铲和镊子轻轻去除覆盖物表面多余的土壤，避免扰动附着在覆盖物表面的土壤。将生物降解地膜（BDM）薄膜切成1厘米见方的小片，直至获得0.5克样品材料。

每个重复样品转移时，将0.5克覆盖物碎片及其附着的土壤转移至含有9.5毫升PBS的25毫升培养管中；向仅含土壤的对照管或覆盖物已完全降解的样品管中加入0.5克土壤，以破坏任何生物膜并使细胞从覆盖物碎片上脱离。将试管在高速下涡旋振荡30秒，然后在水浴中超声处理10分钟，再再次涡旋振荡。

这将获得与覆盖物碎片相关的微生物细胞的均匀悬浮液。对样品进行连续稀释时，准备一支含有4.5毫升无菌PBS的培养管，并从原始悬浮液管中取样，向深孔板的三个孔中每孔加入450微升PBS。

取0.5毫升加入到4.5毫升无菌PBS中，高速涡旋振荡30秒后，获得5.0 × 10⁻³的稀释液；取50微升加入到96孔板中含450微升PBS的孔内，用移液器轻柔吹打混匀10次，重复梯度稀释操作，直至完成5.0 × 10⁻⁶的稀释度。使用火焰灭菌的弯玻棒将每个稀释度的100微升均匀涂布于含氯霉素的PDA平板琼脂表面，以抑制细菌生长。将平板直立放置30分钟，使液体充分吸收。

然后用多聚甲醛密封培养皿，以防止未知分离物的孢子逸出。将培养皿倒置，在黑暗条件下于20摄氏度的生物安全柜中培养五天，使生长迅速和生长缓慢的真菌均能形成菌落。使用无菌牙签检查稀释平板上是否形成单个分离的菌落。

轻轻接触一个菌落，然后依次触碰真菌基本培养基、含塑料的真菌基本培养基以及葡萄糖基本培养基平板的琼脂表面，以在塑料膜上方接种琼脂小滴。用牙签在琼脂点表面轻轻摩擦，随后在塑料膜上划过。从同一来源菌落重复接种，直至获得四个接种点。

将平板在黑暗条件下于 20 摄氏度培养 5 天后，在每个平板上进行划线重复。比较平板以鉴定那些在覆盖物碎片上生长优于在仅含琼脂作为碳源的最低培养基上生长的分离菌株。这些菌株可能是覆盖物降解菌。

GMM 平板应表现出最多的生长量，因为它是含有葡萄糖的培养基的阳性对照平板。此时土壤分离物可能尚未完全纯化，因此使用无菌牙签从定植于覆盖物上的真菌中刮取接种物，并在马铃薯葡萄糖琼脂平板上划线分离，然后密封平板并培养五天。经过五天的培养后，将出现单个分离的菌落。

确认这些新纯化的菌落在平板生物测定中表现出与最初可能不纯的分离物相似的覆盖物定殖能力。一旦通过平板生物测定鉴定出潜在的覆盖物降解菌，需进一步采用液体生物测定进行最终确证实验，即使在覆盖物下方缺乏琼脂的情况下也要进行。在此严格制备的培养基中，覆盖物碎片确实是微生物生长的唯一碳源；实验开始时，需将表面已灭菌的覆盖物碎片接种至不含任何其他添加碳源的真菌培养基中，每个微生物分离物设若干重复。

准备三支用于接种的试管。第一支为实验管，内含5 mL标记为FMM的最小培养基，并加入预定尺寸的覆盖物碎片。第二支为阴性对照管，内含5 mL不含碳源的最小培养基。

以及三，一个含有五毫升葡萄糖液体的阳性对照，此处标记为 GMM。此外，准备一份含有待测覆盖物的最小培养基的重复管，但不进行接种。

该对照管将显示在培养和收集新鲜孢子后由污染引起的任何微生物生长。根据文本方案，在无菌转移罩中，用一百万个孢子或酵母细胞接种先前准备好的培养管，密封管盖，并在20摄氏度下避光静置培养。每周观察样品的生长情况。

接种后第一周内，真菌在覆盖物碎片上的菌丝生长可能已可见，尤其是覆盖物碎片边缘处；对于浮游性酵母，应通过在600纳米处测定光密度来监测其生长，因为丝状真菌可能直接附着在覆盖物碎片上。通过肉眼观察评估生长情况，并在仅含基本培养基的对照组中通过光学显微镜和/或扫描电子显微镜加以确认。注意寻找微小的白色菌丝，其体积过小可能无法引起光密度的明显变化。

采用分光光度法。使用巴斯德移液管吸取菌丝，通过微分干涉差显微镜观察。在平板生物测定中，从一种名为 Weed Guard Plus 的纤维素类地膜（作为阳性对照）以及一种名为 Biore 的淀粉基塑料地膜中，分离出三种可能具有降解地膜能力的菌株后进行上述操作。

将它们在液体生物测定中孵育68天，然后在进行扫描电子显微镜观察前收获。正如预期的那样，在所有样品上均观察到真菌菌丝，但XX和YY除外，在纤维素对照覆盖物上的分离物中观察到杆状细胞。

在仅含FMM的对照组中未观察到生长，如本图所示的未接种（UN）对照组；植物源性纤维中的导管元素仅在部分纤维的成行排列上表现为轻微的斑点状痕迹，尽管在纤维素对照覆盖物的三个接种样品中均观察到了真菌菌丝。导管元素仅在SS样品中清晰可见，表明纤维素材料的降解暴露了其下木质化的导管结构。分离株SS通过18S核糖体DNA初步鉴定为属于索拉里亚目（Sodales）中的索达霉属（Soda mye）。对于淀粉基塑料覆盖物的分离株，在仅含最低限度培养基的对照组中未观察到显著生长；在VV和ZZ分离株的培养管中，轻轻振荡后仅可见单个白色斑点，并通过微分干涉相差显微镜对分离株VV进行了观察。

该样本为一团孢子团，推测为初次接种后残留的物质。针对分离株 zz。该团块由疏松的菌丝网组成，直径约 0.2 毫米，表明原始孢子接种物已萌发，但未进一步生长至超出本图所示范围。

如基于淀粉的塑料地膜的未接种对照组（UN）所示，可观察到表面呈凹凸不平的质地。白色特征物的身份尚不明确，但在由分离株 VV 定植的薄膜中，这些特征物已消失。而在由分离株 zz 定植的薄膜中，白色颗粒和凸起均已消失。

此外，后一种样品显示出裂隙在整个BDM表面分离物中的均匀分布。利用核糖体DNA的特定片段，初步将VV和ZZ鉴定为青霉属（Penicillium），而ACE则属于座囊菌目（hypo）内的类群。尽管该方法可为农业行业中塑料地膜的生物降解提供见解，但也可应用于任何其他在环境中生物降解性存疑的塑料。

例如，可能最终进入海洋环境的塑料。这些塑料是否用于食品工业？我。