从培养的人类神经前体细胞分化获得的神经元进行激光显微切割分离

以下实验的总体目标是建立一种人类神经元培养模型，鉴定神经元标志物，并分离出高纯度的神经元群体用于基因表达分析。该目标首先通过扩增人类神经前体细胞，以持续获得前体细胞供应来实现。第二步，将神经前体细胞培养在包被有黏附因子的培养皿中，并添加分化补充物和神经营养生长因子，以诱导其分化。

接下来，进行神经元标记物的免疫荧光染色，以确定分化后的神经前体细胞的命运。最后，对培养在PEN膜载玻片上的神经元进行激光捕获显微切割，以促进神经元特异性基因表达分析。获得的结果显示，分化后的神经前体细胞主要具有神经元特性。

基于免疫荧光染色和神经元捕获技术。通过激光显微切割，可将人神经前体细胞扩增并分化为富含神经元的培养物。对于体外研究，由于这些培养物中含有一些胶质细胞，可利用激光显微切割技术分离出纯化的神经元群体。

本次操作将由本显微镜核心设施的高级研究助理 Ron Bouchard 演示。开始实验时，取一份来自胎儿脑组织分离并冻存的人类神经前体细胞，迅速将其复苏至 37 摄氏度，随后加入含有 15 毫升预热神经基础培养基的 T75 培养瓶中，培养基中添加 10 纳克/毫升的 EG F 和 FGF。细胞培养三天后，将神经球转移至 15 毫升离心管中，以 1000 转/分钟离心 5 分钟收集细胞。离心后弃去上清液，保留约 100 微升培养基，将细胞沉淀转移至 einor 管中。

100 微升的细胞沉淀足以分装到两个 T75 培养瓶中。如果细胞量较少，则应减少培养瓶的数量，因为神经前体细胞无法在过稀的条件下增殖。若分装较稀，需通过反复吹打 50 次，将神经球彻底解离为单细胞悬液，操作时保持 200 微升枪头紧贴离心管底部。

使用显微镜观察神经球解离的进展情况。随后，将细胞悬液等量分装至两个 T75 培养瓶中，一个用于继续扩增，另一个用于诱导分化。

然后将培养瓶放入孵育。通过离心更换标记用于扩增的培养瓶中神经前体细胞的培养基，随后弃去旧培养基并加入新鲜培养基。

每四到五天更换一次培养基，直至神经球达到其原始大小，即 300 至 500 微米。为开始将神经前体细胞分化为富含神经元的培养物，将单个盖玻片放入 24 孔板的每个孔中，并通过向每个孔加入 500 微升浓度为每毫升 100 微克的多聚-L-赖氨酸进行包被。在室温下孵育培养板 30 分钟，然后吸除多聚赖氨酸溶液。

用去离子无菌水冲洗培养板，再次吸去液体。接着，每孔加入500微升含5微克/毫升小鼠层粘连蛋白的溶液，包被培养板，37℃孵育30分钟。孵育结束后，用PBS洗涤各孔，再次吸去液体，并将培养板置于组织培养超净台中晾干。细胞传代后第四天，将标记为诱导分化的锥形瓶中的小型神经球转移至已包被的24孔板中。

当神经球贴附于培养皿后，约6小时孵育，以每孔约500个神经球的密度加入，弃去增殖培养基，加入分化培养基。分化培养基由神经基础培养基、B27添加剂、N-G-F、B-D-N-F、D-B-C及视黄酸组成。将培养板放回培养箱中继续培养两周，即可获得富含神经元的培养物。

用 PBS 清洗神经元一次，然后用 4%多聚甲醛固定 30 分钟。固定后，用 PBS 清洗细胞三次。随后，将细胞在室温下用通透缓冲液孵育 60 分钟，以进行免疫染色前的处理。

接着，将多克隆抗体和单克隆抗体加入含3% BSA的PBS中，并加入各孔中。每个孔中加入不同的抗体组合，于4°C摇床上避光孵育过夜。次日上午，用PBS洗涤盖玻片3次，然后在室温避光条件下，加入抗兔IgG-PSI3和抗小鼠IgG-FITC二抗，孵育90分钟。

用 PBS 清洗盖玻片三次。然后在载玻片上加入 10 µL 封片介质。从培养皿中取出盖玻片，并将其有细胞的一面朝下置于封片介质上。

轻轻擦去多余的封片剂，并用指甲油密封边缘。为准备显微切割，首先将神经前体细胞在PEN膜上分化为富含神经元的培养物。载玻片涂有聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白。

所有后续步骤均需在无 RNA 酶的条件下进行。接着，使用 Histo Gene 染色剂对培养物进行染色，以观察细胞；Histo Gene 可将细胞核染成紫色，细胞质染成浅粉色，从而可根据其独特的形态学特征轻松区分神经元与胶质细胞。将玻片依次置于 75% 乙醇和去离子无菌水中各 30 秒。

然后将切片置于一张Kim擦拭纸上，加入200 µL Histo Gene，静置20秒。接着将切片依次放入去离子无菌水、75%乙醇、95%乙醇和100%乙醇中，每种溶液中各放置30秒。

然后将样本置于二甲苯中5分钟，并用Kim擦拭纸干燥5分钟。接着将PEN膜载玻片覆盖在普通载玻片上，放入Veritas激光显微切割系统（LCM）中，并使用软件操作。拍摄导航图像，以识别完全不含星形胶质细胞的纯神经元区域。

使用绘图工具标记这些神经元。接下来，通过计算机控制的精度和自动化，以两步法进行这些区域的激光显微切割。第一步，以70毫瓦的激光功率和2,500微秒的脉冲，将红外激光发射到多个位点，使膜与帽结合。

接下来，使用紫外切割工具在10毫伏的低功率设置下切除标记区域。通过上述步骤的组合，可将标记区域选择性地捕获到LCM捕获宏帽上。当捕获的神经元数量达到至少100个时，使用显微镜将膜从帽上取下，并将其置于试管中。

使用POPU RNA提取试剂盒从LCM样品中分离总RNA，并用DNase处理。然后根据试剂盒说明书，利用ribo amp RNA扩增试剂盒对提取的RNA进行扩增。最后，使用TaqMan探针进行实时逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）分析，以检测人神经丝重链。

通过使用多聚L-赖氨酸和层粘连蛋白包被的表面，结合特定分化的生长因子，对培养4天的神经球进行诱导分化，可获得富含神经元的培养物。两周后，在低密度区域可获得如图所示的富含神经元的培养物。这些细胞也可能分化为星形胶质细胞，如图中所示。

也可使用生长因子CNTF（而非用于神经元分化的因子）来诱导星形胶质细胞的分化。神经元分化可通过针对特异性神经元标志物——new N和synapsin、乙酰胆碱酯酶以及突触素（synaptophysin）、BDNF和GAP-43的抗体进行鉴定。阳性染色表明分化后的细胞具有原代神经元的特征。此外，星形胶质细胞可通过STAT3和GAP的免疫阳性染色加以鉴定。

对在聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白包被的PEN膜载玻片上分化的神经元进行激光显微切割。图中所示为经组织染色剂染色的神经元。为观察细胞，可使用激光勾勒出目标细胞的轮廓，激光会熔化PEN膜，使其粘附至上方放置的收集帽上。最终，可将大量细胞依次勾勒并收集至同一个收集帽中，用于DNA或RNA分析。

观看本视频后，您应能充分了解如何利用激光捕获显微切割技术分离神经元。