活体小鼠中表达荧光蛋白的亚细胞结构成像的活体显微镜技术

本实验的总体目标是观察小鼠唾液腺中的亚细胞结构。首先通过外科手术暴露唾液腺，同时避免对其造成损伤；第二步，将麻醉后的动物固定在显微镜载物台上。

接下来，需小心放置唾液腺，以免在最后步骤中影响其功能。使用定制的固定装置稳定小鼠，以尽量减少因动物心跳或呼吸引起的运动伪影。最终，可通过活体显微镜成像观察亚细胞结构的动态变化。

麻醉前，称量小鼠体重以确定合适的麻醉剂剂量。接着，通过吸入异氟烷进行预麻醉。动物失去意识后，每隔15分钟通过趾夹反射确认镇静状态，并在手术期间将小鼠置于保温灯下。

使用直肠探头温度计监测动物的体温。接着，用电动剪刀剃除小鼠颈部的毛发，然后用浸有乙醇的纱布擦拭颈部腹侧，并用无尘纸擦干残留的酒精。随后，用一对钝头弯镊子在咬肌下端末端处轻轻提起一小块皮肤，并做一小切口。

将剪刀插入切口，刀尖朝上，朝向皮肤内侧，反复张开剪刀刀片数次，直至皮肤与下方组织分离。然后从唾液腺基部附近开始，此处神经导管和血管将腺体与身体其他部分相连。用剪刀剪下一条已分离的皮肤，宽3毫米，长10毫米。

清洁伤口区域后，形成的开口呈椭圆形，大小约为 8 × 12 毫米。两个唾液腺均应可见。使用注射器将光学耦合凝胶涂抹于切口中央，然后用新的无菌纱布将凝胶向外擦拭，直至清除所有血液和松散毛发。

现在，使用一对7号镊子找到右侧唾液腺的尖端，在腺体顶端上方几毫米处的结缔组织处夹住。然后撕开腺体周围的结缔组织，注意不要损伤实质组织。一旦暴露腺体，轻轻将结缔组织从腺体上分离，并用生理盐水冲洗掉任何出血。

确保分离所有结缔组织，并完全暴露腺体。在将动物放置到显微镜前，先在显微镜载物台上放置一块厚纱布和一个加热包，同时在加热包顶部再覆盖一层薄纱布。将盖玻片置于载物台中央。

然后将小鼠右侧朝上放置在纱布上，用一小段医用胶带固定其右前肢腹侧，并用丝线钩住门齿。在丝线与前肢之间施加一定张力，并将它们固定在载物台上。再用更多医用胶带，使唾液腺自然放置。

在盖玻片中央。使用连接到显微镜载物台的塑料楔形物进一步固定小鼠的头部和胸廓。然后将一小块镜头清洁纸放在腺体上方。

轻轻拉伸腺体，并将定制的固定器置于腺体上方。然后使用金属夹和医用胶带将稳定器牢固地连接到载物台上。用纱布和加热垫覆盖动物，并使用配备柔性热电偶探针的温度计实时监测暴露腺体的温度。在动物稳定后，立即采用落射荧光照明，聚焦于腺体表面。

评估毛细血管中的血流情况以及组织的整体形态。使用488纳米激光激发GFP基因。将峰值功率设置为0.5毫瓦，以避免串联番茄蛋白发生光漂白。

使用561纳米激光，将峰值功率设置为1毫瓦。现在通过预扫描选定区域来评估组织的稳定性。如果样本不稳定，需相应调整动物位置，以找到合适的焦平面。

在预扫描模式下，逐渐移动物镜靠近盖玻片，直至分泌颗粒、分泌颗粒结构和质膜清晰可见。随后，为观察分泌颗粒的动态过程，采用每帧0.5至2秒的扫描速度，图像分辨率为256 × 256像素，空间尺度为0.2微米/像素。

为了最佳地观察颗粒和质膜，将光学厚度设置在0.9至1.2微米之间。接着，拍摄视野图像作为参考点。最后，通过皮下注射0.1毫克/千克新鲜配制的异丙肾上腺素和生理盐水，诱导胞吐作用。

注射后一分钟。分泌颗粒与质膜的融合将通过颗粒周围GFP荧光的增强以及串联番茄肽在其限制膜中的扩散来检测。在GFPM番茄小鼠中，这些结构呈现为清晰可辨的形态，表达胞质GFP及由虚线所示的膜靶向串联番茄肽。

在单个 aser 细胞中，串联的番茄肽标记了细胞边界，如箭头所示。同时在 aser 细胞内清晰可见的细胞核中也检测到 GFP。细胞质中的 GFP（由箭头指示）被排除在分泌颗粒之外，这些分泌颗粒呈现为直径约 1 至 1.5 微米的暗色圆形囊泡。

为观察外排事件，在注射异丙肾上腺素后，显示了一个由星号标示的富含分泌颗粒的质膜代表性区域。可见靠近质膜的某些分泌颗粒周围，绿色荧光蛋白（GFP）荧光水平升高，如绿色箭头所示。此外，如红色箭头所示，串联番茄肽在与质膜融合后扩散至分泌颗粒的限界膜中。

30 至 40 秒后，分泌颗粒逐渐崩解，其界膜被整合到顶端质膜中。本文所展示的方法代表了细胞生物学领域的一项重大突破，因为它能够在活体小鼠中对特定的膜运输过程动态进行成像。