使用直接标记探针的稳定3D DNA FISH方法

以下实验的总体目标是以稳健的方式研究单细胞中特定基因组位点的空间组织结构。首先制备荧光标记的探针，使其最终能够结合并高亮显示目标基因组区域。接下来的步骤是将待测细胞黏附、固定并通透于载玻片上，以允许探针进入细胞。

随后进行探针与细胞DNA的同步加热变性，接着过夜杂交，并通过洗脱步骤去除非特异性结合的探针，再用dpi进行复染。通过荧光显微镜观察细胞核，最终可揭示特定基因组区域在细胞核内的空间定位。该方法有助于回答核内结构研究领域中的关键问题，例如确定基因之间的功能相互作用。

该DNA FISH实验方案的主要优势在于其快速、稳定且具有多功能性。尽管我们以E Es细胞为例演示了该方法，但它同样适用于多种其他类型的细胞。由100至250千碱基大小的BACs制备的直接标记探针可稳定产生明亮的信号；若需要更小的探针，亦可实现。

使用 40 至 50 千碱基的 smid，或含有 5 至 10 千碱基插入片段的质粒。利用 ensemble 或 UCSC 基因组浏览器鉴定对应于特定基因的 bac 或 smid 克隆。为制备高质量的 bac DNA，可采用反复沉淀法或 commercially available kit；制备物的纯净度与所需探针的体积成正比。

标记过程分为两个步骤进行。首先，使用缺口平移法（nick-translation）引入氨基烯丙基-dUTP；其次，通过化学偶联连接活性荧光染料。

值得投入时间制备高亮度的探针，因为这些探针对于获得强健的FISH信号至关重要。此步骤可与细胞处理并行进行，无需在实验当天一开始就完成。首先将10至20纳克直接标记的探针与六微克CO 1D NA混合，总体积为六微升。

然后加入9.7微克鲑鱼精来源的单链DNA一微升，用水将混合液体积调整至100微升。接着加入10微升3摩尔的醋酸钠和275微升乙醇，涡旋混匀。

将混合物置于-20摄氏度下沉淀至少一小时。接着，在4摄氏度下以最大转速在微量离心机中离心30分钟。然后用70%乙醇洗涤沉淀物，并再次在4摄氏度下离心5分钟。

接下来将沉淀物风干。然后重悬，将其悬浮于五微升的去离子甲酰胺中。

在37摄氏度下以1000 RPM振荡进行酰胺反应，并用铝箔包裹以避光。30分钟后，加入五微升硫酸葡聚糖混合物，继续振荡孵育10分钟。细胞贴附于载玻片的能力因细胞类型而异。

针对每种细胞类型，需通过实验确定最佳沉降时间和细胞密度。为获得一致的结果，细胞应处于单细胞悬液状态。将小鼠胚胎干细胞粘附到载玻片上时，首先在载玻片上圈出细胞将要滴加的区域。

使用疏水性笔划出区域后，将每80至100微升正常培养基中含有20,000至50,000个细胞的细胞悬液加入该区域内，并将载玻片置于湿润的培养箱中孵育约3小时，使细胞贴壁。细胞贴附后，将载玻片轻轻浸入4% PFA中固定10分钟。载玻片应平放于类似吸头盒的托盘中。

使用室温试剂在共平面染色缸中进行操作。首先，用三羟甲基氨基甲烷氯化物（Tris chloride）淬灭细胞 10 分钟。其次，使用皂素与吐温 X-100 混合液对细胞进行透化处理，持续 10 分钟。

现在用 PBS 清洗细胞两次，每次五分钟。清洗后，将细胞在 20% 甘油中孵育至少 20 分钟。此时，载玻片可于 -20 摄氏度的 50% 甘油中保存数周。

存放一天或更长时间应可增强信号强度。在继续操作前，务必在 PBS 中的 20% 甘油中将细胞平衡至室温。现在，使用液氮对载玻片进行三次冻融循环。

一次一张载玻片，待噼啪声停止后，数秒钟内将载玻片移至纸巾上解冻，等待不透明的冷冻甘油消失后再重新冷冻。最多可舒适地轮换处理15张载玻片，完成三个冻融循环。随后将载玻片在PBS中洗涤两次，每次五分钟。

然后将玻片在 0.1 摩尔盐酸中孵育 30 分钟。盐酸处理后，再用 PBS 洗涤 5 分钟。接着用更强的皂素与 Triton X-100 混合液对细胞再次进行透化处理，持续 30 分钟，以将玻片上的表面活性剂洗去，使用两次各 5 分钟的 PBS 洗涤。

现在可将载玻片放入50%甲酰胺的XSSC溶液中进行平衡。此步骤应持续至少10分钟。在平衡期间，将探针上下吹打混匀数次，然后每细胞位点转移10微升至适当大小的盖玻片上。从甲酰胺中取出一张载玻片，用纸巾擦去细胞周围多余的液体，但切勿让细胞位点干燥。

现在将盖玻片翻转，轻轻盖在载玻片的细胞上，用橡胶胶水将盖玻片密封固定在载玻片上。

让胶水完全干燥，并将载玻片避光保存。接着，将载玻片在加热板上精确加热至 78 摄氏度，持续两分钟。此步骤必须正确执行。

在此步骤中，盖片必须保护细胞免受光照，以尽可能保持细胞核形态。防止细胞干燥以及确保热盖温度准确至关重要。接下来，将载玻片放入装有湿润纸巾的避光盒中以提供湿度，并在37摄氏度下过夜孵育。

开始此操作时，先将盖玻片周围的橡胶胶水剥离。然后将每张载玻片放入过量的SC溶液中，直至盖玻片松动并滑落。接着，在45摄氏度下，用含50%甲酰胺的两倍过量SC溶液洗涤载玻片15分钟。

盖上水浴锅盖子以避光。然后在63摄氏度下用0.2×SSC洗涤载玻片15分钟，接着在45摄氏度下用2×SSC洗涤5分钟，最后在室温下用过量SE洗涤5分钟。

后续所有步骤均在室温下进行，首先用 PBS 洗涤 5 分钟，然后用 DAPI 染色液对切片染色 2 分钟，再用 PBS 孵育切片 5 分钟。在加盖盖玻片时，将 10 微升封片介质滴加到合适大小的盖玻片上，每个细胞区域对应一滴。然后吸去细胞区域周围的过量 PBS，注意不要使细胞干燥。

将盖玻片翻转，移至载玻片上，并按照鱼探针制备方案使用指甲油封片。NIC 转录后，应可见 DNA 涂片，大部分片段大小在 150 至 700 个碱基对之间。化学偶联后，可通过分光光度分析检测探针中荧光染料的掺入情况。

使用此类探针时，通过这些质量控制步骤来评估探针质量至关重要。采用落射荧光显微镜进行自动成像具有可行性，但要求荧光信号清晰、易于识别，且背景信号较低。

这是一幅原始视野图像。以下图像代表已通过自动识别和分析的细胞核。每个细胞核的右上方及下方两侧显示了不同的等位基因间和基因座间距离。

在此放大图像中，白色斑点代表每视野中已识别的细胞核。这些直方图显示了上方绿色信号与下方红色信号之间的最大等位基因间距离。所有数据均来自P 20期生殖细胞，探针位于不同染色体上，覆盖HBB和HBA基因以及一个组蛋白基因簇。

这些是使用覆盖 mic、KC 和 Q1 基因的反向探针染色的胎肝细胞核示例。通过这些图像可获得荧光原位杂交信号的核内坐标，并可计算基因组区域之间的空间关系。等位基因间的距离以细胞核半径的分数形式绘制。

在此数据中，红色探针之间的距离明显比绿色探针更近。共聚焦显微镜检测（需要更强信号）也可行。图像堆栈用于在染色体区域内部对鱼探针信号进行三维建模。

这两个探针（红色和白色）分别位于小鼠七号染色体的两端，整个染色体涂染以绿色显示。观看本视频后，您应能够充分理解如何执行 DNA FISH，以研究单个细胞中特定基因组位点的空间定位。在尝试此操作时，重要的是要记住，所有处理步骤均可能影响细胞核结构，因此必须在遵循本方案的同时设置适当的对照。

还可以进行免疫荧光原位杂交等其他方法，以回答基因与蛋白质之间空间关系等其他问题。