在免疫系统完整的人源MUC1转基因小鼠中诱导侵袭性移行细胞膀胱癌：一种用于免疫治疗开发的模型

以下实验的总体目标是有效诱导针对膀胱癌相关肿瘤抗原的细胞毒性T淋巴细胞反应。该目标通过在表达人源肿瘤相关抗原mach one的小鼠中诱导膀胱癌来实现。随后，将一种多肽疫苗注射入小鼠体内，从而引发针对mach one特异性的细胞毒性T淋巴细胞反应。

然后分离血清、肿瘤和脾脏，并分别对这些组织进行细胞因子、抗原及免疫应答的分析。通过使用蛋白质印迹多重检测、荧光微球法、免疫分析、免疫组织化学以及活细胞斑点分析，我们可以评估肽疫苗对抗膀胱癌的效果。您好，我是格雷戈里·韦茨（Dr. Gregory Wetz），加州大学戴维斯医疗系统位于加利福尼亚州萨克拉门托的研究科学家。

与现有方法（如异种移植）相比，该技术的主要优势在于，异种移植需要使用免疫缺陷的宿主，而我们的模型采用的是具有完整免疫系统的转基因小鼠，该小鼠表达一种与人类肿瘤相关的抗原，正是肽疫苗所针对的目标。接下来将由我与Daniel V以及Chaga博士、Audrey Gutierrez博士共同演示这些技术操作，他们均为研究科学家，工作于Michael de Gregorio博士的实验室及加州大学戴维斯分校健康系统。在给予第一剂N-丁基-N-4-羟基丁基亚硝胺（O-H-B-B-N）以诱导膀胱癌之前，需对每只小鼠进行下颌下静脉采血，采集全血并置于血液凝固管中，静置30分钟使血液充分凝固。

从第八周开始，使用不锈钢20号灌胃针，每周口服给予O-H-V-B-N五次，持续12周。第20周时，用600 µL的0.9%无菌生理盐水溶解每瓶冻干肽疫苗，并使用生理盐水通过27号、0.5英寸针头反复抽吸六次，充分重悬。调整浓度，使所需剂量在最后一次给予O-H-B-B-N后以100 µL体积给药，并在最后一次O-H-B-B-N给药八周后，使用25号针头每周注射100 µL疫苗，持续八个星期为一个周期。

通过二氧化碳窒息法处死所有小鼠后，将每只小鼠置于解剖板上，并用针固定四肢。接着，使用镊子和剪刀在腹部上区做一横向切口。将剪刀插入表皮层与腹壁之间的切口，借助镊子轻轻将皮肤与下方组织分离。

从水平切口处沿中轴线向小鼠前端做一垂直切口。随后将皮肤与肋骨分离，使用1 mL注射器和22号针头穿刺心脏，用镊子和剪刀平稳、均匀地抽取血液。在生物安全柜内剪开并掀开其余表皮层。

无菌条件下切开腹壁和腹膜。取出膀胱肿瘤用于免疫组织化学（IHC）或IHC以及Western blot检测。将膀胱肿瘤标本放入组织包埋盒中，并在冰冻福尔马林中固定过夜。

在室温下，采集脾脏用于细胞活力分析，并采集血液样本以进行多重荧光微球免疫测定。使用 200 µL 分析缓冲液预润湿 96 孔滤板底部的滤膜，确保滤膜完全浸透。

然后使用96孔板真空装置轻轻抽滤，除去滤液，并用纸巾吸干板底部的液体。使用多通道移液器向指定用于空白孔和标准品孔的孔中加入25 µL血清基质，向指定用于对照品和待测样品孔的孔中加入25 µL检测缓冲液。接下来，向各自指定的孔中加入25 µL空白标准品、对照品及待测样品。将磁珠混合物涡旋振荡20秒，然后转移至储液槽中。

然后将25微升珠子混合液加入每个孔中。用盖板膜覆盖，避免光照，于室温下以500转/分钟在摇床上振荡孵育2小时。弃去孔内液体，每孔加入200微升PBST洗涤液，洗涤两次，每次洗涤后弃去液体并拍干。为配制检测抗体溶液，取适量0.1% PBST缓冲液与检测抗体加入15毫升离心管中，涡旋混匀10秒。

然后每孔加入25 µL。在室温下以500 ×g振荡培养板一小时。随后弃去液体，每孔加入200 µL的0.1% PBST洗涤两次，每次均弃去洗液并吸干。每孔加入25 µL新配制的链霉亲和素-藻红蛋白（SAPE）或链霉亲和素-异硫氰酸荧光素（FICO eryn），将培养板置于振荡器上，在室温下以500 ×g孵育30分钟。

用PBST洗涤两次，弃去液体。为重悬磁珠，向每孔加入100 µL 0.1% PBST，于500 RPM振荡至少2分钟。在生物安全柜中使用Luminex LX 200仪器读取并分析该板。

将小鼠脾脏通过100微米尼龙组织筛网，处理至无菌培养皿中的5毫升无菌PBS中。将脾细胞悬液小心叠加于无菌15毫升离心管内3毫升淋巴细胞分离液上。以600 ×g离心15分钟。

为了将淋巴细胞与红细胞分离，将梯度上方分层的淋巴细胞转移至新的无菌15毫升离心管中，使用1.5毫升带螺口盖的离心管。使用计数和活力试剂对淋巴细胞进行系列稀释，然后在Muse仪器上进行分析。

根据制造商的说明书准备共培养板的样品和条件布局图，向每孔中加入100 µL的中等肽或乱序肽。再向每孔加入100 µL细胞悬液，并在37°C下孵育过夜。按照制造商提供的ALI斑点检测说明书进行操作，并使用解剖显微镜分析已发育的Aly斑点板。

通过计数每孔中对应于各分析物的着色斑点数量来量化结果。在本研究的转基因小鼠模型中，这些斑点对应于每孔中斑点形成细胞的数量，该模型通过化学致癌物诱导。O-H-B-B-N 导致膀胱癌发生率较高，主要为移行细胞癌（TCC），部分为鳞状细胞癌（SCC），这与人类膀胱癌相似，如本图所示。

O-H-B-B-N诱导8周后，mach one转基因（TG）小鼠和野生型小鼠的膀胱癌发生率均为67%。苏木精-伊红染色证实存在移行细胞癌（TCC）和鳞状细胞癌（SCC），其中TCC占主导地位，比例为2:1。在这些肿瘤中，我们观察到从低级别、非侵袭性到高级别、侵袭性肿瘤的多种类型。所有mach one膀胱癌标本经免疫组化（IHC）检测均显示mach one表达呈阳性。

在模型构建过程中，我们对第8周至第28周之间的血清炎症性细胞因子水平进行了连续监测。我们观察到，从造模开始直至研究结束，炎症性细胞因子水平随时间推移逐渐升高。该细胞因子变化模式与我们先前在肺癌模型中观察到的结果非常相似，强烈提示炎症性细胞因子水平的升高可能与肿瘤的发生发展相关。

为评估肽疫苗对血清细胞因子反应的影响，研究结束时处死15只接种疫苗和14只给予安慰剂的雄性TG小鼠，并在末次疫苗接种后24小时采集血液。多重分析显示，疫苗组小鼠血清中TNF-α、干扰素-γ、IL-2、IL-12和IL-17的水平升高。

与安慰剂组相比，接受疫苗治疗的小鼠体内TNF-α、干扰素-γ和IL-17水平显著升高。这些结果提示该多肽疫苗可诱导Th1型极化的细胞因子反应。为评估该多肽疫苗引发的Th1/Th2免疫反应，通过干扰素-γ和IL-4 ELISpot法对脾细胞进行了检测。图中显示的是将活性淋巴细胞接种至ELISpot板后，对分离的淋巴细胞活力进行的评估结果。本实验结果明确且特异性地显示出淋巴细胞对多肽产生干扰素-γ反应，证实了该多肽疫苗可诱导Th1型免疫反应。

该技术为癌症免疫学领域的研究人员探索利用晚期膀胱癌的临床前模型开发新型免疫治疗药物铺平了道路。