早期变态期植入技术用于昆虫飞行行为监测

您好，我是来自阿尔伯特·博斯博士实验室的 Alex Derber。我在北卡罗来纳州立大学电气工程系工作。今天我们将演示一种在曼氏裂头绦虫性成熟早期变态阶段植入电极的新型外科手术方法。

在此称为早期变态期植入技术的过程中，植入的电极会在昆虫的蛹期变态阶段整合到其组织中。该技术的主要优势在于能够与昆虫的神经肌肉组织形成机械稳定且电学可靠的耦合，从而便于研究昆虫的飞行神经生理学。在成虫阶段，家蝇（IC Mensa）经历一个约持续40天的变态生命周期。

Mensa 从卵阶段开始其生命周期。经过七到十天后，幼虫将孵化并进入三龄幼虫阶段。幼虫阶段共有五个龄期，在每个阶段中，幼虫都会进行能量获取和生长。

第五次蜕皮后的5到6天，昆虫将进入早期蛹期。在蛹期阶段，昆虫的组织会发生广泛的程序性退化，随后进行再生。为羽化为成虫蛾做准备，昆虫需要经历17至19天的时间。

在幼虫早期阶段，进入晚期幼虫阶段之前，在晚期幼虫阶段期间，我们通过手术将一个导电电极植入幼虫的背部胸部。组织会在植入的电极周围发育，从而将电极固定在昆虫体内。在数天的过程中，插入幼虫胸部的电极会随着昆虫整个组织系统的重建，在最终成虫阶段（蛾）成为昆虫身体的一部分。

在变态发育过程中，将电极植入胸部的间接飞行肌内。这些间接控制翅膀运动的肌群包括背腹肌和背纵肌。本文将演示如何将电极插入背腹肌，该肌肉间接负责翅膀的上拍运动。

通过此次植入，我们将无线记录昆虫在进行“ya”运动时背腹肌肉的肌电图。当昆虫被悬浮于一个LED环境内的电磁悬浮平台上时，该平台将刺激其运动。早期变态阶段植入技术的操作流程始于构建一块印刷电路板，该电路板将作为植入电极与记录仪器之间的接口。

将导线电极焊接到印刷电路板上，该电路板连接至一个扁平柔性电缆连接器。首先，使用细头永久性记号笔和剪刀，测量并裁剪一块0.5厘米×5厘米的覆铜板。使用同一支细头永久性记号笔，在覆铜板上绘制三个0.1厘米×5厘米的焊盘，作为蚀刻掩模图案。

使用直尺等直边工具沿铜箔层压板切割件的整个长度进行标记。确保标记清晰粗实，且彼此不重叠。若标记线相互重叠，电极将发生短路。

连接扁平柔性电缆连接器时，应将覆铜板切割件移至通风区域进行操作，最好在通风橱中完成标记的蚀刻，以免电路板报废。处理印刷电路板蚀刻剂时需格外小心，因其具有毒性，若被摄入或吞食可造成伤害，且接触皮肤可能引起刺激。将聚四氟乙烯胶带贴在覆铜板切割件的一端，沿长度方向覆盖约一厘米。

接着，使用透明胶带将铜箔层压板的切割件固定在量杯内壁，使铜箔条的一半浸入蚀刻液中。将量杯置于旋转平台上，旋转 20 分钟。然后将蚀刻后的铜箔层压板从量杯中取出，并放入盛有水的烧杯中浸泡 10 分钟。

为了冲洗残留物，将异丙醇涂在一块精密擦拭纸上，擦拭标记处，以露出未蚀刻的铜焊盘。彻底清除永久性记号笔的痕迹。将印刷电路板切割成边长约一厘米的小方块。

印刷电路板蚀刻完成后，需要对电极进行安装前的准备。建议在显微镜的视觉辅助下进行以下步骤。使用锋利的刀片，将镀层不锈钢丝切割成两段，每段长3厘米；该不锈钢丝的镀层部分直径为0.11英寸，裸露部分直径为0.008英寸。

这些不锈钢丝是将插入昆虫胸部的活性电极。使用剃刀片从每根金属丝的两端各去除四到五毫米的塑料涂层。接下来，进行切割。

取一段长0.7厘米的绝缘不锈钢丝，用于制作接地电极的尖端延伸部分。使用剃刀刀片轻轻去除涂层（操作方法同前一步骤），或用烙铁加热将其熔化。接着，将一段利茨线裁剪至4.5厘米长度。

也可使用电感线作为该焊料。将先前准备好的0.7厘米长的不锈钢尖端连接至利茨地线。地线末端应露出不锈钢尖端。

使用聚四氟乙烯胶带将刻蚀好的电路板固定在焊接工作区。将胶带贴在电路板上，使焊盘露出1至2毫米，以便将电极焊接到电路板上。焊盘上被胶带遮蔽、无需焊接的末端将插入FCC连接器中。

使用聚四氟乙烯胶带对齐三根电极导线，使每根导线的一端能够焊接到电极板上对应的焊盘。两个工作电极应焊接到电路板边缘附近的焊盘上，接地电极应焊接到中心焊盘上。

在电极焊盘上涂抹不锈钢助焊剂，以方便焊接。注意避免因焊料过多而导致焊盘之间短路。将电极分别浸入丙酮和异丙醇中，各10分钟。

为了清除焊料残留物，可将溶液分别倒入不同的培养皿或烧杯中。为提高清洁效果，可在浸入过程中将电极置于超声波清洗仪中，并使用清洁溶液。昆虫在昼夜交替期间最为活跃。

因此，应使用自动插座定时器在昆虫培养箱内建立人工昼夜循环。定时器应设置为模拟7小时黑暗和17小时光照的周期。每天观察曼杜卡眼蝇（manduka sex eye pu eye），以确定合适的接种时间。

在翅膀发育完成后约一天，蛹眼即可准备植入。展翅后七至四天内进行深色斑点植入最为成功。底部颜色较深的蛹已准备好进行手术，植入电极以麻醉蛹体。

将它们置于4°C的冰箱中约六小时。接下来，准备插入工作区。工作区应包含异丙醇、锋利的镊子刀片和30号规格的皮下注射针头。

可选地，可使用氰基丙烯酸酯粘合剂以增强电极的固定效果，并通过将镊子和电极浸入异丙醇或用其擦拭进行消毒。六小时后将眼球从冰箱中取出，并转移至工作区。确定背侧胸部对应于目标肌群的位置。

本研究关注负责翅膀上拍运动的背腹肌。使用锋利的刀片或皮下注射针头，轻轻在体壁外角质层上划出一个 1×1 厘米的方形区域。然后用镊子缓慢剥离这些碎片。

使用镊子去除胸部暴露区域的翅毛。可选择性地使用真空装置辅助清洁过程。应尽可能彻底清除毛发，以避免影响插入的电极。

缓慢将针头插入胸部翅膀附着处的中胸区域约五毫米，形成两个针对肌群的插入点。请记住打孔的位置，因为一旦丢失这些位置可能难以再次找到。将蛹固定在桌面上，并可选择使用镊子引导两个记录电极进入这两个插入点，以增强机械稳定性。

用导线涂抹器在胸部每个插入点周围彻底清理毛发，并大量涂抹氰基丙烯酸酯粘合剂。为ELO准备一个笼子，其墙壁和天花板覆盖有粗糙且有纹理的材料，以便昆虫攀爬。羽化后，可使用带孔的纸板箱或包装纸。

准备一个刚性固定装置。使用长约六厘米、直径两毫米的细棒。小心地将此细棒穿过突出部分下方的孔洞。

塑料搅拌棒。此步骤可使用棉签或金属丝。将棒的两端固定在笼子表面，使蛹无法滚动。

将蛹放置在笼内，使其中胸朝上。过度移动可能导致电极损坏、失去固定或使插入无效。接地电极应插入腹部或胸部的远端部位。

为避免信号串扰，电极插入可在幼虫发育的后期阶段进行，也可在昆虫羽化后进行。无论选择在幼虫阶段还是成虫阶段插入，接地电极的插入位置都需在幼虫阶段进行准备。本文演示的是成虫阶段的接地电极插入操作。

将蛾置于4°C的冰箱中6小时。为进行冷处理固定，准备注射操作区域，包括异丙醇、尖头镊子、30号皮下注射针头、氰基丙烯酸酯胶水、用于涂胶的金属丝，以及可选的热灼器和可选的牙科蜡棒。与之前相同，在接触蛾之前，先将皮下注射针头浸入异丙醇中；将蛾固定后，从记录电极后方腹部约1至2厘米处作为注射位点，缓慢插入针头以刺穿腹部，完成注射侧的准备。

针头插入深度不应超过四毫米。如果在插入部位出现血淋巴，说明针头插入过深，导致操作成功的可能性降低。使用镊子将接地电极小心插入插入部位，并施加压力使其深入至三到四毫米。

固定电极位置，并用导线在插入部位周围涂抹胶水（此步骤可选）。为进一步增强插入部位的机械强度，可使用热灼烧器，在尖端收集一小块2至3毫米的蜡滴。将尖端靠近插入部位并加热，使蜡包裹电极并将其牢固固定。

冷却后，让昆虫恢复一天时间以从插入操作中恢复，然后再进行实验。需要使用一块带有扁平柔性电缆连接器的转接板，将昆虫上的电极板连接到三角Biosystems国际头级放大器单元。该转接板采用蚀刻铜层压板制成，需按照之前在焊台处制备电极板边缘的步骤进行准备，并在制备好的板一端焊接一个扁平柔性电缆连接器。

可将一个10针扁平柔性电缆连接器焊接到电路板上，使连接器两侧的两对引脚以及中间的一对引脚分别与三个铜焊盘接触。接下来，将三根30美国线规的连接导线焊接到三个焊盘上。在电路板的另一端，将三个微型连接器焊接到适配板的三个焊盘上，用于连接示波器读取信号，具体方法如前所述。

在下一阶段，将两个连接器垂直于板的边缘放置。中心连接器应略微向上倾斜，远离板平面，并将这三根导线的另一端连接至头部固定装置连接器。由 Triangle Biosystems International 提供。

然后应将头级电路板固定在悬浮框架的顶部，以提高电极的可靠性并观察信噪比。可获取有线示波器记录。在部署无线记录系统之前，需将示波器连接至多通道交流神经记录放大器。

将放大器参数设置为高通截止频率1赫兹、低通截止频率20千赫兹、增益100。将适配板上的每个雌性迷你导线连接器连接到放大器输入通道。从笼中取出植入电极板的昆虫。

当组织处于活性状态时，可将一块组织置于蛾子下方，使其在测量前 resting。使用镊子将电极板滑入适配板上的扁平柔性电缆连接接口。移除昆虫下方的组织，观察肌电图尖峰的产生。当昆虫拍打翅膀时，在示波器上采集并保存数据。

该图显示了使用示波器在翅膀拍打前和拍打期间从某块肌肉记录到的肌电位信号。信号经过100倍放大处理，并使用了1赫兹的高通滤波器和20千赫兹的低通滤波器。在静息期未观察到肌肉电位。

翅膀拍打过程中肌肉电位的频率约为15至20赫兹。在完成并验证示波器测量后，应采集无线肌电图（EMG）信号。可构建电磁悬浮平台，用于在限制飞行状态下无线记录六斑始叶螨（Manus sex）的肌电图信号。

悬浮平台由一个框架构成，该框架设计用于平衡一个系留装置。自由漂浮的悬浮状态使得框架以及附着其上的昆虫能够实现 ya。在不使用系留导线约束的测试过程中，该框架可通过熔融沉积成型设备进行快速原型制作。

这个带有磁体的框架由基座平台内的一系列电磁铁悬浮支撑。该悬浮平台位于LED arena内部，arena由60块面板构成，每块面板包含5×7阵列的独立LED。arena由APIC 18 F 45 20微控制器控制，可模拟顺时针和逆时针旋转，并可调节旋转速度。

设置TBSI无线记录系统。将TBSI头部级联连接到悬浮平台上的适配板连接器。在昆虫活跃时（最好在其黎明活动期）将其从笼中取出。

使用镊子。小心地将电极板插入悬浮框架上的扁平柔性电缆接口中，使昆虫稳定地悬挂在装置内。将磁力笔靠近头部支架上的磁性开关，以启动无线数据传输。

一盏蓝灯会亮起，表明头戴装置已激活并准备就绪，可以开始记录。关闭房间内的灯光以确保完全黑暗，并在计算机上打开 TBSI Neuro Aware 软件。您可以使用一盏红灯为房间提供额外照明。

选择合适的配置文件。本实验步骤中使用的配置文件为默认的 W5 设置。然后点击初始界面左上角的“开始运行”按钮。

要开始观察信号，请在TBSI记录系统上选择“所有通道”窗口标签，以观察肌电图（EMG）信号。为确保可靠的无线连接和电极正常工作，请打开LED实验区域的所有组件、稳压直流电源以及微控制器。缓慢调节悬浮平台，使其在实验区域内保持平衡。

在 nor aware 界面左侧面板中选择记录到二进制的选项卡。设定录制时间及文件保存位置。选择适当的输出设置以保存您的数据。

点击开始按钮，以在 TBSI 记录软件中启动记录会话。这将把您的文件保存为 .next 文件，该文件可导入常用的数据处理程序中。

观察昆虫是否朝与LED移动方向相对应的方向飞行。反转LED的移动方向，并确认昆虫也随之改变飞行方向。此操作可根据需要重复多次。图中箭头表示LED图案的旋转方向。

箭头变为黄色。当昆虫完成逆时针旋转时，箭头在昆虫完成顺时针旋转时变为蓝色。播放的视频速度比正常速度快50%。

该图显示了在静息期翅膀拍打前和拍打期间，从无线设备获取的单块肌肉的肌电势信号。在此期间未观察到肌电势。翅膀拍打时的肌电势频率约为15至20赫兹。

这里我们刚刚展示了一通道记录。然而，使用此装置获取的多通道记录可用于观察飞行动作过程中多个肌群之间的协调活动。我们刚刚向您演示了如何将电极插入早期变态期的雄性蛹中。

在瞳孔期的后期进行插入操作至关重要，以确保插入时间既不过早也不过晚。否则，可能会导致难以获得稳定的电极装置。我们还向您展示了如何组装必要的电子元件，以便在昆虫被悬浮于LED arena中时，对间接飞行肌进行无线EMG数据记录。

感谢观看，祝您的实验顺利。