利用设计核酸酶进行小鼠基因组编辑

本实验的总体目标是借助设计型尾部核酸酶（talon）快速生成基因缺陷型小鼠。首先设计并构建编码特定talon配对的DNA载体，作为体外转录生成talon mRNA的模板。接下来的步骤包括分离受精的小鼠卵母细胞，并通过显微注射将talon mRNA注入其中。最后一步是将注射后的卵母细胞通过手术移植到假孕的代孕母鼠体内。

产生的F零代后代通常表现出基因组序列的位点特异性缺失，这往往导致靶基因功能的丧失。尽管本文介绍的方法可为小鼠基因功能研究提供见解，但其基本方法也可适用于其他模式生物，如大鼠和鱼类。首先，访问该网站上的TAL效应子核苷酸靶向网站。

选择 TN 靶向程序，并粘贴目标基因的序列。本实验方案中，请使用 ad gene 平台提供的 P-C-A-G-T 七种 TALEN 表达载体，以及 Golden Gate TALEN 和 T effector 试剂盒。

如果使用其他载体或组装试剂盒进行TALEN组装，则最佳间隔序列长度和尾部RVD重复单元数量的设置可能有所不同，请在“使用预设架构”选项下选择Miller等2011年的设置，然后在G替代标签页中选择NN。程序将根据此列表生成一个包含潜在靶点序列的文本文件。

选择所需的TALEN配对并进行Golden Gate连接。该方案适用于大多数常用实验小鼠品系，包括C57BL/6J和BDF1。在四周龄时，对10只雌性供体小鼠进行超数排卵，通过腹腔注射5单位的孕马血清促性腺激素。48小时后，同样通过腹腔注射给予5单位的人绒毛膜促性腺激素，注射人绒毛膜促性腺激素后立即以1:1的比例将雌鼠与适龄雄鼠合笼交配。同日准备假孕的代孕母鼠。其他情况。

第二天早晨，处死雌性个体，并通过解剖输卵管回收受精卵母细胞。随后将卵母细胞团块放入含有1毫升M2培养基的器官培养皿中。向含有卵母细胞团块的M2培养基培养皿中加入10微升0.1%牛透明质酸酶溶液，以去除所有卵丘细胞。

然后使用口吸管通过两到三次更换M2培养基来清洗胚胎，以去除透明质酸酶。对于尚未从卵丘细胞中分离的胚胎，继续进行透明质酸酶处理。分离后的胚胎可保存在M16培养基中，置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下，直至进行显微注射。

制备100微升注射溶液，每微升含有10纳克的每种尾部Nuclease mRNA配对物，然后在30,000 ×g条件下离心30分钟，以沉淀可能堵塞注射针头的任何颗粒。

然后将混合物置于冰上保存。计划在下午早些时候将卵母细胞在其原核期进行显微注射。将约100个胚胎浸入M2培养基中，并在矿物油覆盖层下，使用倒置显微镜（不带微分干涉差光学系统）进行操作。

在20倍放大倍数下，挑选具有明显原核的细胞。可使用空的注射毛细管对卵母细胞进行分选，在使用前将注射毛细管吸取一到两微升注射溶液，然后将其连接至显微注射头。

然后用持卵毛细管吸取选定的细胞，将核酸酶 mRNA 注射到细胞质中，注射位置宜浅。避免接触原核。注射体积应保持较低。

一旦出现胞质膨胀的最初迹象，立即撤出针头。通常情况下，约有80%至90%的胚胎可在无即时损伤的情况下存活。为增加注射的mRNA量，可在显微注射可用卵母细胞后，使溶液进一步浓缩。

使用口吸管将它们转移到M16培养基中。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育胚胎1小时。然后将存活的胚胎转移至假孕的代孕母鼠体内。

在显微注射前一天，通过将3至6月龄的CD-1雌性小鼠与VAs去势雄性小鼠交配，诱导其假孕。次日早晨，挑选具有明显阴道栓的雌鼠作为胚胎受体。未使用的雌鼠将在三周内退出假孕状态，之后可再次使用。

将麻醉后的代孕母鼠腹部朝上放置在温暖的表面上。然后用70%乙醇喷洒切口区域进行消毒。将湿润的毛发从预定切口处梳理开。

现在用剪刀切开腹腔，并将子宫角外置。操作时，牵拉附着在卵巢上的脂肪垫，并用血管夹固定生殖器官。

同时，务必使用预热的0.9%氯化钠溶液保持器官湿润。此时，挑选12至20个有活力的胚胎，并将其装入一根细玻璃毛细管中。先用口吸管吸取少量空气泡，然后用精细镊子将胚胎吸入管内。

轻轻夹住扩增区上游的输卵管壶腹部（UCT），使用30号针头在UCT管壁上刺出一个小孔。将装有胚胎的毛细管插入孔中，轻轻吹出胚胎至扩增区内，直至观察到毛细管中的气泡已被完全排出。随后取出毛细管。

立即将生殖器官复位至体腔内，并用单根缝线关闭腹膜腔。接着，使用一到两个9毫米的伤口夹关闭皮肤。将动物放回其饲养笼中，并在其麻醉作用消退前进行监护。

然后将雌鼠以每组2至3只的稳定社交群体进行饲养，以尽量减少术后前三天的应激反应；务必在饮水中添加镇痛剂（如DEF Falcon），用于所有经设计核酸酶靶向小鼠基因组中每个位点的实验小鼠。设计了一种基于PCR的检测方法，用于鉴定携带目标突变等位基因的 Founder 动物。在第一个示例中，Founder 动物来源于尾部注射一对核酸酶的受精卵。

通过T7核酸内切酶对PCR产物进行消化，分析小鼠朊病毒蛋白基因的编码区靶向情况。T7核酸内切酶消化实验依赖于由突变型和野生型等位基因扩增出的PCR产物DNA链之间形成异源双链结构。在单个 founder 小鼠的靶向基因组区域中，Talon诱导产生的突变表现为除全长PCR产物外，还出现250和110个碱基对长度的消化条带。

或者，如果设计的核酸酶配对序列的间隔区中存在合适的诊断性限制性酶切位点，则可对PCR产物进行限制性酶切消化。在第二个示例中，ZFN靶向小鼠Rosa 26位点内含子中的一个XPO限制性酶切位点。此处未被酶切的条带表明存在突变。

星号标记表明，未检测到任何消化产物，强烈提示该 founder 小鼠在靶基因的两个等位基因上均携带突变。对这些未被消化的 PCR 产物进行克隆和测序发现，founder 小鼠可能在一个靶向等位基因上携带两种或多种不同的修饰。野生型序列的缺失表明靶基因已被完全敲除。

观看本视频后，您应能够充分理解尾部核酸酶的设计、尾部核酸酶构建体的组装，以及如何通过直接显微注射这些构建体来制备突变小鼠。该方法可适用于其他类型的定制核酸酶，例如锌指核酸酶或 Cas9 CRISPR 系统。此外，通过同时共注射核酸酶和相应的基因靶向模板，该方法还可促进同源重组介导的基因组修饰。