使用微流控芯片进行活体成像及损伤反应研究 果蝇 幼虫

以下实验的总体目标是利用改良的微流控芯片，以非侵入性方式固定果蝇幼虫，从而实现活体成像。将三龄幼虫放入芯片中，并加入少量油以帮助密封幼虫。接着，将芯片置于幼虫上方，使其身体恰好位于腔室内部。

将芯片连接至注射器，以便施加真空。幼虫的运动受到限制，动物腹侧的结构被推近至盖玻片。使用共聚焦显微镜可轻松成像，例如感觉神经元轴突末端的细节，以及诱导神经损伤后节段神经的再生情况。

其他用于固定活体成像、大量氯仿乙醚或异氟烷麻醉剂中 josepha 的方法。该技术的主要优势在于避免了此类毒素的使用，从而防止其干扰动物的生理状态。由于无需使用毒素，带来的额外好处是幼虫更安全，便于操作。牢固的固定效果使得研究人员能够对快速事件进行成像，例如快速的轴突运输以及细胞内钙离子浓度的变化。

单个幼虫可在芯片中被固定并多次成像，从而实现长时间的活体观察。可对持续长达72小时的生物学过程进行成像。开始本实验前，请先获取一个样品PDMS芯片以尝试本方案。

使用21号分注针，可参照文本方案阅读如何从SU八孔模具制备A-P-D-M-S芯片。在PDMS芯片的真空端口处打孔，以用于倒置显微镜。将23号针头从其基部取下，通过几次扭转拆下锁紧接头。

然后将针尖插入一小段聚乙烯管中，确保管子覆盖针尖至少一毫米。使用剃刀片切去多余的管子，留下一个可形成密封的塑料环。

将23号针头插入真空端口的孔中。对于直立式显微镜，使用21号点样针在PDMS芯片侧面再刺一个孔。此孔将从侧面提供对第一个孔的通路。

然后将23号针头尖端和管环插入侧面孔中。在PDMS芯片顶部孔的上方贴上一片双面胶带以密封顶孔。将一段20厘米长的聚乙烯管一端连接至插入芯片真空口的针头尖端，另一端连接至三通阀的一个端口。

然后将一个20毫升注射器连接到阀门剩余两个端口中的一个，使最后一个端口保持开放。用透明胶带清洁PDMS芯片。将一段胶带贴在芯片底部。

确保胶带接触整个PDMS表面，然后撕下胶带。重复此清洁方法三次。由于PDMS芯片可重复使用，彻底清除油渍残留物非常重要，因为油渍可能影响PDMS与玻璃之间的粘附性。尽早进行觅食转移。

将三龄幼虫从培养基转移到含有水的培养皿中。幼虫长度必须在3.5至4毫米之间，以确保能正确适配芯片。清洗幼虫以去除培养基。

接下来，将一滴卤代碳700油置于玻璃盖玻片中央，用镊子轻轻夹起一只已清洗过的幼虫，短暂地将其放在轻质擦拭纸上吸干，然后转移到油滴中停留10秒。油滴应足够小，以确保幼虫的气管未被油覆盖。

然后将幼虫短暂地放置在干净的玻璃盖玻片上，并将其转移至另一张盖玻片。以此去除更多的油。注意幼虫的方位，以便成像神经索和节段神经。

腹面应朝下，易于识别的气管应朝上。现在将PDMS芯片轻轻放置在幼虫上方。

将幼虫对齐至微腔室的中心位置，使其后端朝向真空孔，且幼虫不接触腔室边缘。对齐后，将PDMS芯片紧压在玻璃盖玻片上，以形成良好的密封。

然后仔细检查幼虫是否完全封闭在微腔室内。现在将三通阀切换至注射器。固定好PDMS组装件，拉动注射器活塞，抽出2至2.5毫米的空气，直至感到阻力为止。

从而形成真空。然后关闭阀门。为确保真空维持良好，需仔细检查幼虫。

应将幼虫身体固定在微室内部，且气管应清晰可见。PDMS芯片的其余部分应与盖玻片接触。此类方向不正确。现在对幼虫进行成像。

若使用正置显微镜，请用双面胶带将芯片的上侧固定在载物台上。成像完成后，释放真空。然后将PDMS芯片从盖玻片上取下。

应立即使用镊子使幼虫活动。将幼虫放回葡萄汁琼脂平板上以恢复。将一只麻醉的幼虫放置于葡萄汁琼脂平板上。

在体视显微镜下，将动物腹侧朝上。为了观察腹神经索和节段神经，需确保幼虫完全不动。定位神经索和唾液腺。

切勿损伤这些结构。找到第三腹节的末端，此处损伤会损害最多的神经，且在不致死的情况下最容易重现损伤。

也可使用五号双星镊子在更靠后的节段进行损伤操作。通过角质层紧紧夹住节段神经5到10秒。操作正确时，角质层保持完整，体壁不会被刺穿。

掌握该操作需要在损伤后将动物腹侧朝下放置于大培养皿上进行练习。动物应能够移动头部并进食。如果损伤成功，则幼虫的后半部分将出现瘫痪。

利用幼虫芯片对单个外周轴突中由驱动蛋白介导的突触小泡运输过程进行成像。这些小泡的顺向运动速度约为每秒1.0微米，逆向运动速度为每秒0.8微米。

采用固定技术进行脉冲紫外染料激光的激光显微手术。借助基因编码的指示剂，观察特定神经元中的钙离子水平。在感觉神经元之后，G camp 3.0检测到钙离子尖峰。

树突被横断。在成像间隔期间让动物休息，可实现对细胞事件的长时间动态观察。在挤压运动神经元的轴突后，近端轴突残端出现了新的出芽。

与此同时，远端轴突形成串珠样肿胀，并通过华勒变性过程发生断裂。利用幼虫芯片进行体内追踪，还可实现荧光蛋白的光转化。在四类感觉神经元中表达的DRA双α微管蛋白融合蛋白，其细胞体部位进行了光转化。

两天内，大量光转化蛋白被转运至感觉神经元的轴突末梢，距离细胞体的原始位置约一毫米。观看本视频后，您应能充分掌握如何利用幼虫芯片对黑腹果蝇幼虫进行活体成像，以及如何实施神经 crush 损伤实验。一旦熟练掌握这些技术，仅需几分钟即可将幼虫放置到显微镜下进行观察。

神经挤压操作同样迅速，因此这些方法可用于大规模实验，例如遗传学研究。该芯片可用于成像果蝇幼虫腹侧的结构。

这些组织包括但不限于肌肉、神经肌肉接头突触、感觉神经元、外周神经以及腹神经索。该方法也可用于幼虫心脏、唾液腺和气管的活体成像。本视频中使用的幼虫芯片适用于体长在3.5至4毫米之间的动物。

对于成像时体型较小或较大的动物，可轻松制作具有更小或更大腔室的芯片。有关制作PDMS芯片的补充设计文件和说明，请参见相关材料。制作PDMS芯片的详细步骤已包含在书面实验方案中。

如果您联系我们，我们可以寄给您一个样品芯片。