一种用于研究昆虫行为可塑性的喙伸展反应实验方案：在基础、生物医学及农业研究中的应用

本实验的总体目标是展示如何在蜜蜂中实现对食物简单反射性反应的行为条件化。首先捕捉蜜蜂，将其固定在束缚装置中，喂食少量分泌液，然后让其适应这种束缚状态。接着选择那些在触角接触蔗糖时表现出足够动机的蜜蜂进行条件化训练。

在条件化过程中，将气味刺激与蔗糖奖励配对呈现，以诱发条件反应。随后，通过无强化试验来检测反应的有无、反应的潜伏期以及反应的持续时间。最后一步是数据分析及对条件化试验和测试试验结果的图形化呈现。

该技术已成功应用于蜜蜂生物学和健康学习行为的研究，此类行为对杀虫剂等干扰性处理尤为敏感，因而能够在亚致死水平上评估这些处理对蜜蜂行为的影响。对该方法的可视化演示有助于理解有效条件反射所需的刺激时序，以及导致效果降低的常见错误。初次接触该方法的研究者往往难以把握实验方案及周边环境所要求的细节精度。

首先，在工蜂从蜂群巢口出发前短暂停留或采食归巢时收集工蜂。每个小瓶仅捕捉一只工蜂。盖紧瓶盖时，应将瓶口保持水平或朝下，以防止蜜蜂逃逸。

采集蜜蜂后，返回实验室，将少量收集管依次放入冰水混合物中。待蜜蜂活动停止后，立即将收集管从冰水中取出，以防过度暴露，并将蜜蜂放入固定装置中。将蜜蜂固定，使其背部朝向固定架的切口部分，头部略高于顶部。

轻轻按压蜜蜂，使其口器伸出固定器边缘。将一条胶带从背侧插入头部与胸部之间，并将胶带自由端牢固地粘贴在固定器侧面。确保固定装置上的胶带平整且绷紧。

蜂体固定装置前端与胶带之间不应有明显缝隙。若有缝隙，蜜蜂可能无法正常伸出其口器，或可能从中逃脱。将蜜蜂固定后，应让其恢复约30分钟，然后再进行喂食。

然后在远离训练区域的地方，在喂食与条件刺激之间的间隔期内，每只蜜蜂喂食约三到四微升的0.5摩尔蔗糖溶液。将蜜蜂置于实验室安静区域的塑料容器中，并在容器内放置浸湿的纸巾。在此期间，于开始条件刺激前几分钟，用一滴0.5摩尔蔗糖溶液接触蜜蜂的触角，以测试其取食动机。

在测试期间不要让它们进食。如果蜜蜂通过伸出喙（psis）作出反应，则表明它们可能具有足够的学习动机，可用于本实验方案。准备就绪后，将玻璃气味注射器插入橡皮泥支架中，并调整位置，使注射器宽端的开口正对蜜蜂，距离蜜蜂10 E。将连接 cartridge 与气流管路及阀门系统的接头牢固地套在注射器的窄端，注射器末端应距离蜜蜂1至2厘米。

每次试验开始时，将束缚好的蜜蜂放置在训练 arena 的支架上，使其触角正对气味 cartridges。让蜜蜂在 arena 中静置 15 至 25 秒，以适应新环境，然后再开始施加气味刺激。按下启动按钮，以启动气味释放的计时装置。

在刺激开始后、呈现非条件刺激之前，观察蜜蜂对气味的反应。每次试验后，让蜜蜂在训练区域继续停留15至25秒，以促进初始记忆的形成。若在试验结束后过早移动蜜蜂，将显著降低每次训练试验的效果。

在呈现气味时，将针头尖端置于蜜蜂前方2至3厘米处以递送蔗糖溶液。使用训练 arena 的边缘来固定注射器，避免其晃动，因为这种移动可能会分散蜜蜂的注意力。在气味刺激呈现期间，会发出一个喂食信号声。

当发出喂食信号时，轻轻触碰蜜蜂的触角，直至其伸出喙，然后立即喂食蜜蜂。气味刺激与蔗糖刺激呈现之间的时间间隔至关重要，理想情况下，这两种刺激应短暂重叠。

如果气味呈现与蔗糖呈现之间的间隔超过几秒钟，蜜蜂的条件化表现将会下降。条件化训练完成后，使用无强化的测试试验来评估蜜蜂对条件化关联的记忆程度。首先，在训练区域上方的三脚架上架设一台视频摄像机，并将镜头对准蜜蜂头部的正面，使触角和喙处于清晰对焦状态。

确保使用一个小型LED灯，用于指示气味刺激的呈现，该灯应放置在蜜蜂后方的一个位置，使其在视频中可见，但蜜蜂无法看到。这有助于在分析过程中识别气味开始和结束的时间。为了获得最一致的结果，在完成所有设置后，使用 freshly prepared odor cartridges 进行测试。

开始测试时，呈现之前所示的气味。在呈现气味前20秒开始记录，并在呈现气味后至少继续记录20秒。测试结束后，使用视频编辑软件对每只蜜蜂对刺激条件的反应进行评分。

采用二分评分系统对蜜蜂的吻部延伸反应进行评分，将反应结果记为阳性或阴性。将蜜蜂B的反应记为阳性。当蜜蜂B的吻部延伸超过由张开的上颚尖端连线所形成的直线时，仅在气味刺激开始后、气味结束前出现吻部延伸的情况下，才记为阳性反应；若在试验过程中未出现吻部延伸，或吻部在气味刺激结束后才延伸，则将蜜蜂B的反应记为阴性。此外，还可记录其他参数，如吻部延伸的潜伏期、延伸反应的次数以及每次条件刺激下的总持续时间。

随着后续条件化试验的进行，刺激强度逐渐增加。对新奇测试气味的反应与条件刺激在碳链长度和/或碳碳位置上的差异程度成比例地降低。这些数据展示了不同新研究人员之间反应的变异性以及条件化训练的成功情况。

对辛醇的反应因实施测试的组别而异。在测试试验中，用作条件刺激的气味引发的反应最强。当使用辛醇作为条件刺激时，与新型气味环十二酮相比，测试期间的反应更强。

同样，当使用甲基环戊酮作为条件刺激时，产生的反应更强。当采用反向配对时，条件反应降低至接近新气味的水平，这说明了精确时间控制对于成功建立条件反射的重要性。该技术的建立为神经科学领域的研究人员探索学习与记忆的神经基础，以及利用蜜蜂等昆虫作为模式生物的研究开辟了道路。

请注意，操作昆虫尤其是蜜蜂可能存在危险。在处理这些动物时，务必穿戴适当的防护装备。