三维模型定量分析乳腺癌细胞侵袭性

以下实验的总体目标是利用三维侵袭实验评估癌细胞的侵袭能力。该过程首先将癌细胞在基底膜基质中进行培养，随后通过光学显微镜观察细胞对基质的侵袭情况，持续五天或更长时间。

在最后一步中，使用荧光抗体对细胞进行标记，以定位目标蛋白。最终，可通过免疫荧光显微镜分析癌细胞的侵袭速率以及蛋白表达的相应变化。与现有的Transwell小室侵袭实验等技术相比，该技术的主要优势在于，三维基质胶侵袭实验能更好地模拟癌细胞在体内生长所处的微环境。

该技术的应用意义在于癌症治疗领域，可通过研究识别出参与癌症侵袭和转移的新蛋白质。在开始培养操作前，需将基底膜基质、P200移液器及移液枪头置于4摄氏度冰箱中过夜冰预冷。次日，使用预冷的200微升移液器枪头，将50微升基质以螺旋方式均匀涂布于共聚焦显微镜用1号玻璃底培养皿的底部。

然后将培养皿放入37摄氏度、含5%二氧化碳的细胞培养箱中，孵育至少30分钟，以使基质完成凝固。当细胞开始脱落时，用胰蛋白酶处理70%至80%融合度的100毫米培养皿中的细胞。加入10毫升培养基以终止胰蛋白酶反应，随后将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。在4摄氏度下，以100 ×g离心3分钟，使细胞沉淀。

每皿基底膜基质取50微升基质液，分装至1毫升微量离心管中，并在细胞离心结束后将管子置于冰上。吸除上清液时勿扰动沉淀，然后重悬。将细胞重悬于1毫升培养基中，随后进行细胞计数。

将2.5 × 10⁴个细胞转移至新的微量离心管中，加入培养基补足细胞悬液至终体积50 µL。然后按1:1比例向细胞中加入50 µL冰冻的基底膜基质，终体积为100 µL。轻柔地将基质与细胞的混合物接种到已固化的基底膜基质上，并将细胞置于细胞培养孵育箱中，使其嵌入基质中。

30分钟后，用2毫升培养基覆盖基质，将培养皿放回培养箱中，并在实验期间每天更换培养基。在实验期间每天使用光学显微镜的10倍物镜拍摄20张微分干涉对比图像，记录悬浮在基底膜基质中的细胞集落。对图像进行盲法分析，以确定细胞集落的星状形成情况。

若观察到细胞簇边缘有一处或多处星状突起，则将其判定为星状菌落。为观察三维菌落的形态发生特征，将细胞从培养箱中取出后置于冰盘上。吸除培养基，随后用两毫升冷 PBS 洗涤菌落三次。

最后一次洗涤后，在 4°C 条件下用 2 毫升 20% 丙酮、80% 甲醇溶液固定细胞 20 分钟，然后将培养皿恢复至室温。当基底膜基质达到室温后，吸除固定液，并用 PBS 按照前述方法洗涤 3 次。最后一次洗涤后，在室温下用 2 毫升 3% BSA 封闭细胞上的非特异性结合位点，封闭时间至少 30 分钟。

然后将细胞在含有3% BSA的感兴趣的一抗溶液中室温孵育。一小时后，用PBS洗涤三次以去除未结合的一抗，吸去一抗溶液，加入用3% BSA稀释的适当浓度的二抗，室温避光孵育一小时。随后用PBS洗去未结合的二抗，再在2毫升PBS中加入Hoechst 33258对细胞核染色五分钟，避光操作。

然后用 PBS 洗涤细胞，去除未结合的 hext，共洗涤 5 次。第五次洗涤后，直接将封片液滴加到基质与细胞的混合物上，并小心盖上玻璃盖玻片，避免破坏基底膜基质与细胞混合物的完整性。将培养皿在室温下干燥过夜，然后使用荧光显微镜，根据本实验所用抗体对应的合适激光波长采集图像。

图示 MDA-MB-231 细胞侵袭三维基质的过程。细胞在第一天嵌入基质中，第三天开始形成星状侵袭结构。到第五天，可观察到细胞对基质的完全侵袭。

随后计数形成的星状克隆数量，并以每皿侵袭性和非侵袭性克隆总数的百分比表示。此外，由于测量连续每日进行五天，因此也可通过这些免疫荧光图像评估侵袭速率。代表性图像显示 MDA MB 2 3 1 细胞形成具有侵袭性的星状克隆，其细胞膜完整性丧失，基底膜蛋白层粘连蛋白五（laminin five）呈弥散性定位，这与中国台湾 MDA MB 2 31 乳腺癌细胞中所观察到的现象形成鲜明对比。

层粘连蛋白五定位于未处理的非恶性MCF 10A细胞的记忆性基底膜完整层中。完成此操作后，可进行与基质细胞的共培养，以回答其他问题，例如癌细胞在微环境形成后是否与基质细胞发生串扰。该技术为肿瘤学领域的研究人员探索癌细胞侵袭和迁移提供了途径，而这两种过程均为癌细胞的转移扩散所必需。