体外 观察前列腺癌患者来源的循环肿瘤细胞与人血管内皮细胞之间E-选择素介导相互作用的方法

本实验的总体目标是利用微载玻片流动装置，研究稀有前列腺癌细胞与表达E-选择素的内皮细胞之间的相互作用。该目标通过以下步骤实现：首先用纤连蛋白包被微载玻片；第二步是在具有较小通道宽度的微载玻片上，于动态流动系统中培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）或VE细胞。

接下来，用抗前列腺特异性膜抗原（PSMA）人源化单克隆抗体标记前列腺癌细胞，该抗体会被细胞内化。最后一步是将标记了抗PSMA的前列腺癌细胞灌注到表达E-选择素的血管内皮上。最终，通过视频显微镜观察前列腺癌细胞与内皮细胞之间的相互作用。

与现有的方法（如平行板流动室和其他动态装置）相比，该技术的主要优势在于，能够在一个动态流动系统中研究稀有前列腺癌细胞（如循环肿瘤细胞）与培养的内皮细胞之间的相互作用。该方法有助于回答转移领域中的关键问题，例如：前列腺肿瘤细胞如何通过血液血管系统发生转移？它们是否采用了白细胞在迁移过程中所使用的相同机制？

通常，初次接触该技术的研究人员会遇到困难，因为该操作需要在灌流条件下，在组织培养罩内于狭窄通道中培养一层内皮细胞。首先，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗微载玻片。然后，使用1毫升锁扣式注射器，将200微升浓度为50微克/毫升的纤连蛋白轻柔地包被在微载玻片上。

用盖片覆盖微载玻片，并将其置于组织培养罩内静置30分钟。随后，向微载玻片中缓慢灌注200 µL预热的完全生长培养基，在室温下孵育20分钟。缓慢加液可避免微通道内产生气泡。

灌流过程中，通过PBS洗涤vex，并加入含0.1%胶原酶和0.05%EDTA的PBS，室温孵育1至2分钟，制备vex悬液。将hve在2毫升生长培养基中以180 × g离心5分钟。随后使用血细胞计数板测定细胞浓度，并将每100微升生长培养基中的细胞数调整至1000万个。

接下来，小心地从微流控小室的入口处移除培养基。使用200微升移液器吸头，将微流控小室举至与视线齐平的位置，并用1毫升锁扣式注射器缓慢将200微升已配制浓度的vex溶液注入通道中。此步骤需格外小心，以防止气泡产生；若出现气泡，应继续灌注稍长时间，直至气泡进入出口通道。

接下来，向微流控载玻片的入口和出口分别加入等量、约80微升的VE培养基。这可以防止细胞向任何方向流动。盖上盖片，并将载玻片置于37摄氏度培养箱中孵育1.5小时。

开始流室组装时，将一个无菌的20毫升注射器、雌性和雄性鲁尔接头、注射泵以及内径为0.04英寸的导管放入培养箱中预热15分钟，以尽量减少死体积。使用内径为0.04英寸的导管。较小的导管直径可防止气泡形成。

接下来，用12毫升温热的VE培养基填充20毫升注射器。彻底排除注射器中的气泡。用VE培养基填充显微载片的进样口。

将此组件连接至微载玻片。轻轻将出口接头连接到微载玻片上。将装置放入培养箱，并连接至注射泵。

然后将泵设置为每分钟10 µL的剪切速率，并将细胞在37 °C的培养箱中过夜孵育。次日，通过移除连接至微滑片入口的接头来拆卸装置。随后移除出口接头二，以在内皮细胞上上调E选择素的表达。

制备含有白细胞介素1β的新鲜培养基。用10毫升注射器吸取培养基。移除芯片入口处的残留培养基，然后加入新鲜培养基，完全充满入口。

将注射器连接到载玻片上。在孵育箱中，于vex的白细胞介素-1β孵育期间，将注射泵设置为每分钟10 µL的剪切速率，持续四小时，同时制备抗PSMA Alexa 488标记的前列腺癌细胞。首先，向MDA前列腺癌细胞中加入0.05%胰蛋白酶EDTA，作用一分钟。

不要将细胞暴露于胰蛋白酶中过长时间，因为它可能影响细胞表面存在的糖肽。以200 × g离心细胞5分钟。随后，将MDA细胞悬液重悬于1毫升Hank's缓冲液中，并加入抗PSMA抗体，在室温避光条件下孵育30分钟，孵育期间需反复悬浮细胞。

30分钟后，以800 × g离心细胞悬液5分钟。吸除上清，将沉淀重悬于1毫升Hank's缓冲液中。计数标记的MDA细胞，并调整最终浓度至每毫升100万个细胞。

用标记的 MDA 细胞填充一个 5 毫升注射器，并去除气泡。打开倒置显微镜，将环形照明设置为 10 倍物镜。将注射泵调节至与显微镜载物台相同高度，并将其设定为每平方厘米 1 达因的剪切应力。

接下来，打开 Zeiss Axio vision 软件。在计算机屏幕上选择物镜。在软件的工具选项下创建一个新文件夹。

在 Axio Vision 中打开智能实验选项，调整设置以记录 30 分钟的 1/32 秒短视频。对于实时荧光视频，请设置图像选项。这些参数有助于使用蔡司 MRM 相机以接近视频帧率的速度获取视频，在计算机屏幕上以 10 倍物镜观察流道的全宽度。使用 CM 接口适配器，并在将含有细胞的注射器和连接器放置到注射泵之前打开汞灯。接下来，将连接器连接至含有经白细胞介素-1β刺激的轴突的微载玻片的已填充进样通道。

将出口通道与连接在管路末端的接头相连。将管路放入培养皿或15毫升锥形管中，以收集流出液。以每分钟10微升的流速开始向微流控芯片中注入液体。

在488纳米波长下，观察内皮细胞与标记的MDA细胞或来自患者的标记循环肿瘤细胞（CTCs）之间的相互作用。使用倒置荧光显微镜进行滤光，开始以第32个短视频记录实验过程。

在回放分析期间，测量细胞的滚动速度。滚动速度通过将细胞在单位时间内移动的距离除以时间来计算。图中显示的是内皮细胞单层的过夜培养物。

在显微载玻片上。标尺显示，使用5倍物镜时可观察到显微载玻片的100%，而使用10倍物镜观察特定介导相互作用时，仅可观察到70%；位于边缘滚动的细胞不计入统计，因此超过70%的显微载玻片区域可用于视频录制与回放分析。箱线图展示了在不同剪切应力条件下，未标记及抗PSMA标记的MDA细胞在白细胞介素-1β刺激的内皮细胞上滚动速度的分布情况。

在较高的剪切应力（10 dyn/cm²）条件下，1 cm² 和 5 cm² 面积上的滚动速度未观察到显著差异。未标记的 MDA 细胞与抗 PSMA 标记的 MDA 细胞之间的滚动速度存在统计学上的显著差异。使用前列腺癌患者血液拍摄的时间拼接视频显示了标记的前列腺循环肿瘤细胞（CTC）与表达凝集素的内皮细胞之间的三种相互作用类型： tethering（CTC 附着并反复附着）、稳定黏附（CTC 即使在 30 秒后仍未脱离）以及无相互作用（非相互作用的 CTC 进入视野）。微载玻片可轻松进行免疫染色，并对抗 PSMA 标记的 MDA 细胞的牢固黏附进行荧光成像。

在白细胞介素-1β刺激的内皮细胞上发生大量渗出的现象可在此处观察到。观看本视频后，您应能够很好地理解如何按照本方案检测稀有细胞（如循环前列腺肿瘤细胞）与表达S选择素的内皮细胞之间的相互作用。此外，还可采用其他方法（如免疫荧光）来回答更多问题，例如S选择素配体的存在情况。

此类技术可帮助研究人员理解转移过程中涉及的不同步骤。