体外 使用过度磷酸化 Tau 蛋白的聚集实验

本实验的总体目标是监测并比较未修饰与高度磷酸化的 tau 蛋白物种的聚集动力学。首先通过拉链辅助催化剂系统生成未修饰和高度磷酸化的 tau 蛋白，以实现该目标。第二步是建立适用于两种不同仪器之一的聚集检测体系。

通过两种不同的硫黄素染料的荧光来监测 tau 蛋白的聚集过程，即硫黄素 S 和硫黄素 T。最后一步是绘制并比较聚集曲线。最终，利用硫黄素荧光在结合聚集态 TA 物种后产生的动力学变化，展示体外 tau 蛋白纤维化依赖于过度磷酸化的增强效应。

您好，欢迎阅读我们的 JoVE 文章《使用高磷酸化 Tau 蛋白进行体外聚集实验》。我叫 Minko，实验将由 Way 进行操作和演示。

本实验方案需要使用近一个月内配制的、相对新鲜的聚集缓冲液。使用前需加入DIO三乙醇至终浓度为1毫摩尔，并准备经过滤的硫黄素T（Thioflavin T）S储备溶液。上述储备溶液均可保存于-20摄氏度，而目标蛋白则应保存于-80摄氏度。

将毛巾置于冰上，然后根据需要使用聚集缓冲液调整其浓度以保持一致。将毛巾与聚集缓冲液在4°C下以20,800 G离心10分钟。随后将上清液转移至另一管中，并置于冰上保存，直至进行聚集反应的配制。

在1.5毫升微量离心管中配制聚集反应混合物。根据表格，每份反应物取100微升即可。根据反应数量计算总体积，并额外增加10%以弥补移液误差。

如有需要，罐中的胡椒可用拉昂酸或聚集缓冲液替代。通过倒置混合反应体系，并将其转移至37摄氏度条件下，无需避光。每隔24小时，向反应体系中补充一毫摩尔的DTT，以维持还原环境，用于测量荧光。

将光谱荧光仪预热约10分钟，以提高计算机软件中测量结果的一致性。在仪器控制中心选择实时显示模式。

将激发波长设置为450纳米，狭缝宽度设为2纳米，发射波长设置为510纳米，狭缝宽度设为5纳米。然后返回仪器控制中心，选择恒定波长分析模式。按上方框架中的“添加”键，以添加一组波长参数。

将标准误差的采集参数设置为1，最大试验次数设置为3，然后点击“添加”。接着点击“运行”以打开数据展示窗口。

现在在数据展示窗口中，单击“开始”操作以打开新的样本对话框，并选择“未知样品”作为样本类型。然后准备反应体系，每100 µL加入98 µL聚集缓冲液和2 µL 3 mM硫黄素S（Thioflavin S）或T，用移液器反复吹打混合液数次，以确保充分混匀。

将其中一种混合液的全部200微升转移至一个FA三重管中，并将其装载到指定位置。然后点击运行以收集荧光数据。从比色皿中取出溶液后，用蒸馏水冲洗三次，并用气流干燥。该检测在阴离子反应中包含荧光染料，可实现连续测量，使用自动多孔板读板仪操作效果更佳。

常规的参数设置虽然同样适用，但受限于手动操作的速度。在96孔不透明黑色板中配制聚集反应混合液。每孔体积为360微升时，每次检测时间点取200微升已足够。

使用移液器充分混匀每个反应。将96孔板在37摄氏度孵育，每隔24小时添加一毫摩尔的DTT，以确保每个时间点均维持还原性环境。进行检测前，提前至少10分钟开启多功能酶标仪和计算机，并启动相应的计算机软件。

将温度设置为 37°C，并选择荧光强度模式。然后将激发波长设为 450 纳米，发射波长设为 5 和 10 纳米。将 96 孔板插入进样仓，按下读取键。

测量后，立即把培养板放回培养箱，然后再分析数据；本实验可使用小型分光光度计进行连续模式检测。在1.5毫升微量离心管中配制聚集反应混合物。200微升的反应体系足以测量一个时间点。

倒置试管以混匀。在37摄氏度或室温下建立反应，并每隔24小时补充添加一毫摩尔的DTT以进行测量。按照无细胞末端标记检测的方法设置尿量计和软件。

将整个混合物转移至Q vet中，并将其放入样品室的样品架内，然后关闭盖子。点击“运行”按钮，以适当的时间间隔采集荧光数据。如果该时间间隔较短（如30或60秒），则可在各次测量之间将Q vet保留在仪器中，直至达到最后一个时间点为止。

将反应从vete转移回样品管，并在完成后将试管放回培养箱。按照先前的指示，使用重组tau蛋白和P tal进行vete的倾斜操作。建立了两种不同的实验方案，用于比较tau蛋白和P tal聚集的动力学特征，该方法利用了黄素类染料（flavin t and s）在结合淀粉样蛋白聚集体（包括tau蛋白和P tal）时产生强烈荧光发射的特性，无论是否使用荧光染料。

在聚集反应中，过度磷酸化 consistently 促进了 tau 蛋白的聚集。通常，T 和 p tal liga 在前 30 分钟内迅速上升，随后显著减缓，包括黄素的作用。T 在聚集反应中导致聚集速率显著降低。

Theof Flavian s 和 t 在反应 160 分钟后均接近平台期。而另一方面，Bio flavin s 并未引起明显的聚集减缓。通过该方法，可在其开发后利用该检测手段进一步研究中枢神经系统中其他与神经退行性疾病相关的易聚集蛋白异构体或蛋白质，以阐明蛋白质聚集在发病机制中的作用。

这种制备高磷酸化蛋白PA方法的技术，可用于该领域的研究，以探索多种疾病的治疗方法及药物开发。