基于釉原蛋白-壳聚糖水凝胶的开发 体外 具有致密界面的牙釉质再生

本实验的总体目标是建立一种利用AMLO和壳聚糖水凝胶进行牙釉质表层重建的制备方案。该过程首先制备酸蚀处理的牙片；第二步，制备新鲜的AMLO和壳聚糖水凝胶。

接下来，将AMLO和kitan水凝胶涂覆于牙片表面。最后，在人工唾液中利用AMLO chizen水凝胶再生牙釉质。最终，可通过超声处理和纳米压痕技术评估新形成层的机械强度及其与天然釉质的结合能力。

该技术的应用前景在于，将其用于成人和儿童的受累牙釉质时，能够阻止早期龋损的发展，重建因龋病而丧失的牙釉质，保存牙齿结构，并防止龋齿进一步进展。本实验操作将由我实验室的博士后研究员Dr. Chittar一人演示。首先选取一颗无人工修复且无龋损的人类第三磨牙。

使用水冷式低速金刚石锯将牙冠纵向切割成两毫米厚的切片，然后通过超声方式去除磨牙的牙根部分。用离子水清洗切片两分钟，再用离子水冲洗三次，以模拟侵蚀性病损。用30%磷酸对两片切片进行酸蚀处理30秒。

然后立即用去离子水冲洗，再进行超声处理。将蚀刻后的切片再次清洗两分钟，并用去离子水冲洗。

再重复三次。以配制卡扎宁储备液：首先将1%（重量/体积）的卡扎宁溶解于1%（体积/体积）的乙酸溶液中，随后在80°C下搅拌过夜。

将溶液冷却至室温后，通过0.45微米滤膜过滤，然后加入1摩尔氢氧化钠调节pH至5.0。配制钙和磷酸盐储备液时，称取氯化钙并配制成0.1摩尔溶液。接着涡旋振荡溶液至澄清，并用1摩尔氢氧化钠将pH值调节至11。

然后称取二巴磷酸钠。配制0.1摩尔的溶液，并涡旋至溶液澄清。为制备AMLO基因改性水凝胶，将960微升新配制的1%esan溶液加入含有200微克重组猪源AMLO基因的离心管中。

然后涡旋振荡溶液至澄清。接着，向含有奥扎尼的AMLO溶液中加入25 µL 0.1 M氯化钙溶液，随后加入15 µL 0.1 M磷酸氢二钠溶液。涡旋振荡溶液5分钟。

然后小心加入一摩尔氢氧化钠，将 AMLO 和 ozan 溶液的 pH 值调节至 6.5。当 pH 值达到 6.5 时，AMLO 和 ozan 水凝胶将形成，从而在 AMLO 和 az 水凝胶中启动牙釉质再生。首先，用一摩尔氢氧化钠将人工唾液溶液的 pH 值调节至 7.0，并将溶液储存在 4 摄氏度条件下。然后使用注射器将约 20 微升的 AMLO 和 chizen 水凝胶涂抹于牙片边缘，置于室温下的干燥器中。

两小时后，向唾液溶液中加入 300 PPM 的氟化钠，然后将牙片转移至含有 30 毫升该溶液的烧杯中。用铝箔覆盖烧杯，随后将烧杯置于 37 摄氏度的烘箱中。最后，在 3 至 7 天后取出牙片，在经 AMLO 和 chizen 水凝胶修复 7 天后，蚀刻的牙釉质表面会形成一层厚度为 15 微米的类釉质层，将牙片置于干燥器中室温下干燥至恒重。

新生成的层由高度有序的晶体阵列构成，晶体直径约为50纳米，优先沿垂直于表面的c轴方向生长。需要注意的是，这些针状晶体被组织成束状结构，类似于天然釉质的基本结构单元。修复层的选区电子衍射图像呈现出弧形图案，表明新生成的晶体具有分级排列的取向。

沿0 0 2方向的X射线衍射分析证实，新生成的层由羟基磷灰石组成，这些羟基磷灰石沿晶体学C轴方向排列，这与扫描电子显微镜及选区电子衍射观察结果一致。本图显示了新生层与天然釉质之间界面的微观结构。需要注意的是，新生晶体的生长方向与原始釉质晶体不同，蛋白质介导的羟基磷灰石生长导致新生晶体相对于天然釉质晶体呈垂直取向。新生层与釉质基底之间的界面处无明显间隙。

在纳米尺度上，釉质与再生的晶体融合在一起，形成了无缝的界面。经过10分钟的超声处理后，在AMLO Genin壳聚糖水凝胶中形成的新生层仍与釉质表面紧密结合，且经tizen水凝胶处理的样本（不含am mologen）其有序结构得以保留。然而，釉质与修复层之间出现明显的大间隙，可清晰区分新生层与天然釉质。

在本实验中，新生成的层中的 AMLO 基原通过免疫荧光标记进行检测，AMLO 基原的存在通过新生成层内出现的绿色荧光得以确认。如图所示，经过酸蚀处理后，釉质表面的硬度和模量分别下降了近 98% 和 88%。使用不含 AMLO 基原的奥扎尼水凝胶处理的对照组，在硬度和模量方面仅表现出有限的改善。

相比之下，在 AMLO 和 ozan 水凝胶中矿化后，其模量增加了近四倍，硬度增加了九倍。在 VI 中进一步通过模型评估后，该方案可拓展用于设计治疗釉质缺陷（如早期龋齿和侵蚀）的技术。