一种用于可视化七鳃鳗（Petromyzon marinus）肝脏变态过程中胆道退化的新型透明化方法

本实验的总体目标是通过组织透明化技术，完整澄清变态期七鳃鳗肝脏及其与肠道连接处的结构，以便对胆道退化进行整体性、结构性和细胞水平的分析。该目标首先通过将组织固定在水凝胶单体溶液中来实现。

接下来，将水凝胶与固定后的组织进行聚合。然后去除固定组织的细胞膜，使组织变得透明。最后进行免疫荧光染色，并利用激光共聚焦显微镜观察变态期七鳃鳗胆道退化过程中的整体结构和细胞变化。

该方法有助于解答生物医学领域的关键问题，例如中枢神经系统中的连接组，以及在我们研究中的血清点变态期间胆道退化现象。该技术的意义延伸至人类胆道闭锁症的治疗或诊断，因为这种罕见的先天性婴儿疾病与血清点变态期间的胆道退化具有相似的特征。我们最初产生这一方法的想法，源于在《自然》杂志上看到一篇新闻报道，并在实验室组会上展示了在线视频，演示该操作流程的将是本实验室的研究生 Ann Scott。在按照文本方案配制磷酸盐缓冲液（PBS）和磷酸盐缓冲液（PB）之后。

在通风橱中，通过混合蒸馏水、40%丙烯酰胺 2%双丙烯酰胺 10×PBS、16%多聚甲醛、醛、皂苷和过硫酸铵，制备400毫升水凝胶。准备1升清除溶液，包含4%十二烷基硫酸钠（SDS）和0.2摩尔硼酸，并在通风橱中配制500毫升80%甘油用于组织处理。将10毫升水凝胶单体溶液分装至15毫升离心管中。

解剖组织样本，并将组织放入含有水凝胶固定液的各管中，在 4 摄氏度条件下固定两天。在通风橱中孵育后，加入 5 µL TEMED 以启动固定组织的聚合反应。充分混匀后，于室温孵育 2 至 3 小时。

孵育后，彻底清除多余的凝胶以透明化组织样本。将每个样本置于15毫升透明化溶液中，在50摄氏度、70转/分钟条件下孵育数天，直至样本变得透明。每天至少更换一次透明化溶液，并清除所有多余的凝胶。

将样品置于含有0.1% Triton X-100的15毫升0.1摩尔磷酸盐缓冲液中，在37摄氏度、70转/分钟条件下过夜孵育。用新鲜缓冲液重复孵育两次。待组织透明化且无多余凝胶残留后，将样品浸入含Triton X-100的磷酸盐缓冲液中的初级抗体溶液中，在37摄氏度、70转/分钟条件下孵育两天。孵育结束后，用15毫升含0.1% Triton X-100的磷酸盐缓冲液在37摄氏度、70转/分钟条件下过夜洗涤组织样品。

最后一次洗涤缓冲液去除后，重复洗涤三次，然后加入含有0.1% Triton X-100和封闭血清的PB缓冲液配制的荧光二抗溶液，在37摄氏度、70 RPM条件下避光孵育一天。随后在37摄氏度、70 RPM条件下，用10毫升含Triton X-100的PB缓冲液洗涤样品三次，过夜；接着在PBS中进行三次过夜洗涤。最后将透明化组织置于80%甘油中，表面覆盖铝箔，过夜孵育。

随后在黑暗或昏暗光线下进行共聚焦显微镜成像，但本视频中为便于观察而开启了照明。在七鳃鳗变态过程中，肝胰胆系统会发生多个重要的发育事件，例如此处所示，胆管和胆囊经历凋亡并退化。采用改良的透明方法处理样本，并使用肝细胞标志物细胞角蛋白19及抗凋亡标志物BCL2进行染色后，通过激光扫描共聚焦显微镜对完整肝脏进行光学切片成像。

染色结果显示，退行性过程发生在变态发育的第二至第四阶段。上方图示为前部区域，下方图示为后部区域。图中显示的是胆道系统，以及肝脏中呈深色树突状的凋亡细胞及其周围的小管和导管结构。

该图展示了在变态发育第二至第三阶段之间的三个肝脏组织，通过共聚焦Z轴扫描系列重建得到的三维图像。图像使用细胞角蛋白19和BCL-2抗体进行标记，胆管树以及呈深色树突状的凋亡细胞分别以白色和黑色箭头标示，周围的毛细胆管和导管结构也可见。此处显示的是处于变态发育第二至第三阶段标本的胆管共聚焦光学切片，管腔内可见胆汁滴。观看本视频后，您应能够充分理解如何对整个组织进行透明化处理，以便进一步开展成像分析。

请注意，使用对苯二甲醛、醛类和聚丙烯酰胺溶液时可能具有极高危险性，因此在进行本实验操作时，必须采取佩戴手套、使用通风橱等防护措施。