Entamoeba histolytica 感染所致上皮损伤的分析

本实验的总体目标是评估宿主与病原体的早期相互作用以及溶组织内阿米巴（TBA.Histolytica）的侵袭潜力。首先制备完整的滋养体、滋养体总裂解物或分泌型滋养体。随后，用适当浓度的不同滋养体与宿主上皮细胞共孵育。

现在利用抗肌动蛋白免疫荧光技术，分析经处理的上皮细胞培养物中特定的溶组织内阿米巴蛋白（ABA histolytica proteins），这些蛋白与上皮细胞的紧密连接相互作用，同时通过跨上皮电阻（trans epithelial electrical resistance）测量细胞旁屏障的变化。综合结果可展示溶组织内阿米巴（TBA Histolytica）引起的紧密连接解体，并明确特定复合物在此过程中的参与作用。该技术的关键优势在于可利用寄生虫的不同产物，评估Eva histo因子向宿主上皮组织的转位，以及证明这些Eva因子的参与。

这些因素影响感染早期全细胞连接的开启。该方法有助于回答阿米巴致病性研究领域中的关键问题，例如理解上皮细胞与溶组织内阿米巴寄生虫之间的分子相互作用。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为他们不了解共孵育时两种细胞的合适孵育时间比例，以及如何获得不同的ELI产物和如何测量TER。

该技术的意义延伸至我们对阿米巴病的治疗，因为诸如E-H-C-P-A-D-H 112复合物等毒力因子可被开发为新型治疗策略的靶点。四、这种体外方法有助于深入了解阿尼卡病毒因子在初始定植位点相互作用中的参与情况，也可应用于其他系统，如仓鼠、小鼠、豚鼠的体内感染模型，以及人体肠道活检组织的培养。

将MDCK细胞置于10毫升补充完全的DMEM培养基中，在5%二氧化碳和37°C条件下培养。在37°C条件下，于15毫升TYIS 33培养基中真实培养1×10⁵个溶组织内阿米巴滋养体。为分离滋养体，将培养管置于冰水浴中冷却5至10分钟。

然后将培养物无菌转移至锥形管中，在4°C条件下以360 × g离心10分钟。随后，小心弃去上清液。向沉淀中加入预冷的PBS缓冲液，倒置试管数次，以在离心后分散细胞。

使用血细胞计数板确定滋养体数量，将滋养体在液氮中快速冷冻一分钟，于4°C解冻并剧烈涡旋。现在用0.02% β-巯基乙醇激活裂解液中存在的蛋白酶。将9×10⁶个滋养体悬浮于3 mL冰浴PBS中，转移细胞至50 mL锥形管中。

现在将滋养体悬液置于37摄氏度培养箱中，以5度倾斜的水平角度放置2小时，以收集分泌产物，随后在360 × g下离心10分钟。使用一次性无菌注射器小心收集上清液，避免沉淀中的滋养体污染样品。然后，为消除任何残留的细胞，将上清液通过0.22微米的醋酸纤维素膜过滤。

现在用0.02% β-巯基乙醇激活蛋白酶，用于免疫荧光培养。将24孔细胞培养板内无菌玻璃盖玻片上的MDCK细胞置于显微镜下观察，直至细胞达到100%汇合度。

将不同处理条件的滋养体用一毫升预热的PBS稀释后加入。包括MDCK细胞加PBS且无溶组织内阿米巴的对照组，以及MDCK细胞加不同处理条件的滋养体但省略一抗孵育的对照组。将培养板放入孵箱中孵育2分钟或30分钟。

随后，用冷的PBS洗涤上皮细胞五次，以去除未结合的分子或滋养体。在湿盒中，用1毫升96%乙醇于-20摄氏度固定并透化细胞数分钟。小心地将盖玻片从孔中取出。

用滤纸从边缘去除多余液体，将带有细胞的一面朝下浸入0.5% BSA封闭液中。室温孵育样品1小时。同时，在PBS中配制一抗混合液。

从封闭液中取出盖玻片，用滤纸吸去多余的液体。将细胞转移至抗体溶液中，并在4°C下孵育过夜。

用一毫升 PBS 洗涤细胞五次，以去除未结合的分子。现在用 PBS 配制两种荧光二抗的混合液。将样品在避光条件下于室温下用二抗孵育一小时，进行细胞核染色。

在避光条件下，于室温孵育细胞，加入 200 µL 0.05 mM dappy 溶液，孵育 3 分钟。随后，通过共孵育实验，利用共聚焦显微镜对样品进行 Zack 断层及 XZ 平面分析。对于每种实验条件，分别加入蛋白酶抑制剂或单克隆抗体，在 4°C 下孵育 20 分钟。

在无菌的 Transwell 可渗透支持物上的上室中，加入 100 微升细胞悬液，在下室中加入 600 微升添加了补剂的 DMEM 培养基。将制备好的 Transwell 滤膜放入培养箱中，并置于倒置显微镜上。确认细胞达到 100% 汇合。

收集并汇集每个Transwell上室的培养基，取50微升该培养基混合物。加入50微升滋养体悬液或PBS对照。然后将混合物转移至含有MDCK细胞的每个Transwell上室中。

立即将STX的两个电极分别浸入每个Transwell中，以测量跨上皮细胞电阻。确保较长的电极接触下室底部，较短的电极被上室中的培养基完全覆盖。溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）在厌氧条件下培养，并于对数生长晚期至静止期早期收获。

此处使用紧密连接标志物ZO-1来观察由紧密连接和黏附连接稳定的上皮细胞之间的细胞接触。通过单克隆抗体进行免疫荧光染色，以研究阿米巴来源的复合物与上皮表面的相互作用。将滋养体、全裂解物或分泌产物施加于上皮单层后，该复合物与紧密连接发生共定位。30分钟后，细胞边界出现不连续的ZO-1染色，并在囊泡中发生内化。

这种破坏在 MDCK 细胞与滋养体以及滋养体之间的接触中最为显著。全细胞裂解物的共聚焦激光显微镜结果显示，毒力复合物向细胞间区域渗透。在紧密连接蛋白 ZO-1 染色发生破坏的寄生虫接触部位出现共定位，导致上皮屏障功能受损，并引起跨上皮电阻下降 90%。

在滋养体与针对该复合物的抗体或蛋白酶抑制剂进行预孵育后，可防止跨上皮电阻（TER）的下降。综合这些数据表明，在溶组织内阿米巴侵袭过程中，蛋白水解活性和黏附特性均为该复合物的重要毒力因子。观看本视频后，您应能充分理解如何分析溶组织内阿米巴毒力因子在感染早期打开紧密连接的作用机制。一旦裂解产物和细胞培养物准备就绪，掌握此项分析技术后可在三小时内完成上皮损伤的检测。

进行该实验步骤时，重要的是必须严格遵守离子作用的精确时间。此外，还可采用其他方法（如免疫共沉淀实验），以探究溶组织内阿米巴毒力因子与上皮细胞蛋白在其发育过程中可能存在的相互作用。该技术为研究阿米巴-宿主相互作用领域的科研人员提供了重要基础，使其能够在仓鼠、小鼠、豚鼠以及人体组织中进一步探索阿米巴病的发病机制。