膀胱平滑肌条收缩力作为评估下尿路药理学的方法

本实验的总体目标是评估膀胱平滑肌组织的生理学和药理学特性。首先通过解剖大鼠膀胱，将其展开成扁平组织片，并切割成包含尿路上皮、平滑肌及神经的条状组织。第二步，将组织条连接至力传感器，该传感器与放大器和刺激器相连，用于测量肌肉的收缩能力。

下一步，建立基础张力和组织活性，然后对组织条施加药物或电刺激。最终，可测量这些刺激对膀胱平滑肌组织收缩性的影响。该方法用于表征病理性和药理性化合物对整体膀胱以及特定膀胱组织成分（如人类和动物尿路上皮中的平滑肌神经）的作用。

该技术在开发治疗多种膀胱功能障碍的疗法过程中被广泛使用，因其在定义明确且受控的环境中，为药理学试剂提供了一种快速、简便且可重复的筛选方法。通过后肢撤回反射消失确认麻醉成功后，剃除动物腹部毛发，然后通过腹部正中切口暴露盆腔器官。接着，识别膀胱和尿道，并在靠近近端尿道的膀胱颈部处进行切断。

为移除膀胱，立即将组织置于盛有通气Creb溶液的涂有硅胶的培养皿中。在处死动物后，用组织解剖针穿过膀胱顶部、颈部及输尿管，以固定组织，便于进一步解剖且不牵拉组织。去除膀胱周围的多余组织，然后从基底部向顶部切开膀胱，使其成为一张扁平的组织片，将纤维化侧朝下、腔面朝上放置。

将解剖针固定在组织的每个角落，然后移除膀胱、颈部和穹窿组织。接着，沿组织纵轴从基部到穹窿切成约2毫米×8毫米的条状，每条两端均夹上组织夹。将条状组织转移至实验腔室，一端连接至力传感器，另一端固定于固定杆上。

现在，轻轻拉伸组织，直至基础张力达到1克。最初，组织 tends to relax（趋于松弛），这表现为基础张力的下降。每隔约15分钟用温热的含氧克雷布斯液清洗组织条，并将基础张力调整至1克。

每次洗涤后，让组织平衡约一到两个小时，直至其不再松弛。当基础张力稳定后，直接向浴槽中加入氯化钾，持续五分钟，或直至达到平台期反应，以检测组织的活性。随后用温热的充氧克雷布斯液洗涤组织三至五次，使其恢复至处理前的状态。

进行药理学平滑肌刺激时，将药物从浓缩溶液中直接加入浴槽中。例如，进行卡巴胆碱刺激时，向每个10毫升的组织浴槽中分别加入10微升相应浓度的刺激剂，待前一浓度引起的反应达到平台期后立即进行。

在平行的组织条上，加入等量的用于平滑肌神经刺激的溶媒或进行电场刺激。将刺激串持续时间设定为3至10秒，串间间隔至少为1分钟。在确定刺激串频率后，运行频率反应曲线，范围从0.5至50赫兹，以确定刺激强度。

逐步增加电压，直至收缩幅度达到平台期，同时保持频率恒定。确定刺激参数后，给予约20至30分钟时间，使电场刺激诱发的收缩稳定，然后再进行药物测试。例如，为检测α,β-亚甲基ATP和阿托品对电场刺激的影响，先绘制两条对照频率-反应曲线，然后向测试条中加入10 µL的α,β-亚甲基ATP，向对照条中加入10 µL的溶剂。

α,β-亚甲基ATP可直接刺激平滑肌中的嘌呤受体，并使这些受体脱敏，从而引起初始的基础收缩。待反应恢复至基础水平后，在所有组织条上重复频率-反应曲线测定。向测试条中加入10 µL阿托品，向对照条中加入10 µL溶剂，电场刺激结束后再次重复测定频率-反应曲线。

通过使用钠通道阻断剂河豚毒素阻断神经传导，验证电场刺激的选择性。最后，取下组织条。将其轻轻吸附在滤纸上以去除多余液体，并用天平称量每根组织条的重量，以确定对平滑肌张力的影响。

使用适当的数据分析软件，选择药物诱导反应峰值前至少 10 至 30 秒的时间窗口以及反应峰值时的信号段，测量收缩幅度，以确定实验处理对神经诱发收缩的影响。在药物诱导反应峰值前和峰值时，至少测量三次收缩的幅度、持续时间和曲线下面积。最后，对数据进行归一化处理，以便在不同组织条和药理学处理之间比较结果。

自发性肌源性活动是平滑肌的一种特征，这种特性在出生后发育及病理状态下会发生改变。在此代表性实验中，来自新生大鼠的肌条表现出大幅度、低频率的节律性收缩，而来自成年大鼠的肌条在脊髓损伤后则表现出小幅度、高频率的活动。成年大鼠肌条的自发性活动幅度可被A-K-C-N-Q通道开放剂降低，这反映了成年平滑肌张力和收缩性的特性。尿路上皮和黏膜对膀胱在储尿和排尿过程中的正常功能具有重要影响。

例如，在此图中，展示了猪膀胱条带中通过激动毒蕈碱受体引起的平滑肌张力随浓度增加而增强的现象。在黏膜存在的情况下，观察到卡巴胆碱处理导致肌肉收缩力下降。

如本图所示，五羟色胺4型受体主要表达于副交感神经，并且其激活可增加乙酰胆碱水平。这些图表说明了五羟色胺4型受体激动剂西沙必利对人膀胱与回肠条带兴奋作用的不同效能和效价。可利用膀胱条带法评估多种受体存在的种间差异。

例如，这些数据表明，铃蟾肽受体拮抗剂对大鼠膀胱具有兴奋作用，而对小鼠或猪的膀胱条则无明显作用。在进行药理学刺激时，需注意药物的浓度、给药时机和作用持续时间。为避免对其他受体产生非特异性作用或导致靶向受体脱敏，在神经刺激过程中，应根据实验目的选择合适的电场刺激参数，并确保刺激不会直接激活平滑肌。