小鼠局部过敏反应的测定

本实验的总体目标是测量血管通透性的变化，以量化局部过敏反应。该目标通过以下步骤实现：首先使动物对某种过敏原（如卵清蛋白）致敏；第二步是通过皮内注射该过敏原对耳部进行激发。

然后将伊文思蓝染料注入尾静脉。最后一步是通过过夜孵育从受刺激的耳部提取染料。随后采用酰胺最终分光光度法测定进入耳部的染料量。

与现有方法相比，该技术的主要优势在于通过分光光度法测量染料外渗量，这意味着该检测不易受到观察者偏差的影响。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为皮内注射和尾静脉注射在技术上具有挑战性，需要大量练习才能熟练掌握。

首先将一份卵清蛋白（ova）储备液置于室温下回温以备使用。待其达到室温后，用1倍磷酸盐缓冲液（1× PBS）将卵清蛋白储备液稀释至浓度为1毫克/毫升。使用5毫升聚苯乙烯圆底试管进行操作。

将试管在中等速度下涡旋震荡，并小心加入等体积充分匀浆的溶液。将明矾逐滴加入卵液中。同时，采用相同方法，制备明矾与磷酸盐缓冲液（PBS）按1:1比例混合的阴性对照溶液。

然后盖紧管盖并将离心管固定到涡旋振荡器上。将涡旋振荡器调至最低转速，持续运行半小时。溶液准备好后，立即开始对BAB小鼠进行致敏处理。

将卵清蛋白-氢氧化铝混合物吸入1毫升注射器中。然后使用27号针头，向每只小鼠腹腔内注射100 µL。接下来的三周内，对阴性对照组小鼠使用不含卵清蛋白的氢氧化铝溶液重复上述操作。

每只小鼠共进行三次注射，末次注射后至少等待两周，再使用冻存的卵母细胞进行局部过敏反应检测。首先在 PBS 中配制 5 毫克/毫升的工作液。加入 5% ISO 氟烷后短暂涡旋混匀。

麻醉一只致敏小鼠，待其完全不动后，将异氟烷浓度下调至3%。现在用一支31G针头的10微升胰岛素注射器吸取10微升卵清蛋白致敏液，并另取一支注射器吸取10微升磷酸盐缓冲液（PBS）。接下来，在解剖显微镜下，用透明胶带（粘性面朝外）包裹一支15毫升锥形管，将麻醉小鼠左耳背侧固定于胶带上。将PBS注射器的针头斜面朝上插入耳片之间，缓慢注入全部10微升液体。

避免刺中血管。成功的注射会产生明显的皮内隆起。将全部体积注入耳部至关重要。

如果液体从注射部位渗出，则该动物不能用于分析。此外，如果针头完全穿透耳部或划伤耳部表面，该检测即为无效，因为这些创伤会干扰右耳的实验结果。在三分钟内，使用相同方法向右耳注射卵清蛋白。

将小鼠转移至固定器中，并置于加热灯下。随后，缓慢向尾静脉注射 200 µL 的 0.5% 伊文思蓝染料。使用 27 号针头时，若在染料完全注射前血管被破坏，快速注射可能造成损伤。

继续在尾巴的另一侧进行注射。现在等待10分钟，然后用二氧化碳处死小鼠，随后进行颈椎脱臼。动物处死后，使用镊子和剪刀取下耳朵。

用镊子夹住耳缘，避免对注射部位施加压力。然后在靠近耳基部的软骨脊处剪切，但不要剪穿软骨脊。尽可能多地收集组织。

现在采取适当的预防措施，将每份700微升的甲酰胺分装到微量离心管中，每管对应一只耳组织。将一只耳组织转移至每根管中，并在63摄氏度的干式加热块中过夜孵育。次日，大部分染料已被提取，但耳组织可能仍呈轻微蓝色。将每个样品各300微升，以复孔形式加入96孔板中。

避免转移任何毛发，且在空白对照中不得产生气泡。用300微升甲酰胺加载两个孔，然后在620纳米处测定吸光度。

减去背景值并分析结果。经PBS致敏的动物对卵白蛋白激发或PBS激发均无反应。正如预期，双耳均保持白色。

在OVA致敏动物中，接受PBS攻击后的耳部组织呈现完全白色或浅蓝色，且颜色局限于注射部位；而接受OVA攻击的耳部组织在染料注射后10分钟内颜色逐渐加深。PBS致敏动物经IDE处理的耳组织在PBS和OVA攻击后均显示可忽略不计的吸光度读数。而对于OVA致敏动物，PBS注射通常导致平均吸光度读数为0.13；相反，50微克OVA攻击则导致平均吸光度读数达到0.58。

用于攻毒的卵母细胞用量可在一定范围内调整。例如，使用20微克的攻毒剂量可得到平均吸光度为0.30的结果。然而，低于20微克的攻毒剂量无法获得可靠的结果。

尽管该技术在掌握皮内注射和静脉注射后具有一定挑战性，但两人协作时，一人进行耳部注射，另一人进行尾静脉注射，可在约15分钟内完成一只动物的操作。两人配合可在大约一小时内完成10只动物的实验。该检测方法具有高度的灵活性，既可用于主动皮肤过敏反应，也可用于被动皮肤过敏反应。

它也可用于多种不同的过敏原。请务必注意，氟烷可能对人类生殖系统产生负面影响。若处于妊娠期，仅可在通风良好的房间内使用，并且必须在诱导室上连接废气吸附罐以中和废气。

使用异氟烷时，应佩戴活性炭过滤口罩，以尽量减少暴露。