小鼠肾上腺嗜铬细胞膜电容细胞贴附式测量方法

本实验的总体目标是检测单个囊泡、胞吐作用和内吞作用。首先，需要对小鼠肾上腺组织进行彻底且完整的消化处理；第二步是从肾上腺组织中分离细胞并进行接种培养。

接下来鉴定嗜铬细胞并进行膜片钳操作，以获得细胞贴附式的电容记录。最终可观察到单个囊泡的胞吐和内吞过程。该技术相较于现有方法（如单离子通道的细胞贴附式记录）的主要优势在于，我们能够检测单个囊泡的胞吐和内吞事件。

该方法的可视化演示非常有用，因为获得吉伽封接（giga seal）较难掌握。此外，在培养板中混合存在的多种细胞类型之间识别目标细胞也可能存在困难。手术准备开始时，需对一把大号和一把小号解剖剪以及两对镊子进行高压灭菌。

然后将解剖托盘放在冰桶上。同时开始向酶溶液中通入5%二氧化碳和95%氧气。通气前溶液呈亮粉色。下一步。

处死并摘除出生后至三天大的小鼠头部后，使用较小的剪刀沿脊柱从颈椎区域向尾椎区域在背部皮肤下浅层剪开。注意剪切时应保持在皮肤下方，避免刺破体腔。接着，将皮肤从脊柱上剥离，以暴露肌肉组织，并清晰显露脊柱。

现在在颈段脊髓处进行横断切口，然后用一把镊子夹住动物主体，沿脊柱两侧做两个平行切口。用另一把镊子抓住脊柱，将脊柱向后剥离，直至暴露肾脏。找到位于肾脏上方的肾上腺后，用镊子将其取出。

然后小心地将肾上腺放入装有封闭液的锥形管中。使用第二把镊子将肾上腺剥离。如果它们粘附在第一把镊子上，将锥形管置于冰上。

腺体可在保存液中保存长达两小时。此时，应检查酶溶液，确保已平衡的溶液颜色已从亮粉色变为粉橙色。接着，将pape加入 freshly bubbled酶溶液中，终浓度为每毫升20至25单位。

然后将丙烷酶溶液加入一个新的锥形管中，并用镊子将肾上腺转移至含有丙烷酶的试管中。在37摄氏度下孵育40至60分钟。随后向每根试管中加入75%的灭活溶液，并在37摄氏度下继续孵育10分钟。

10分钟后，轻柔地将腺体转移至新标记的离心管中，并用培养基清洗腺体三次。清洗后，将腺体放入200 µL培养基中，然后使用200 µL移液枪枪头轻轻反复吹打腺体。吹打时，用200 µL移液枪枪头向下的力量使腺体保持在管底，轻柔缓慢地处理组织。务必采用缓慢、连续的吹打动作，切勿快速或剧烈移液。吹打完成后，再加入250 µL培养基，使培养基总体积达到450 µL。

接下来，将七个12毫米经PDL预包被的盖玻片放入一个60毫米×50毫米的培养皿中。然后将60微升含细胞的溶液分别接种到七个盖玻片上。接种完成后，将培养皿置于37°C培养箱中孵育30分钟。

孵育后，轻轻向培养皿中加入5毫升预热的培养基，然后继续孵育24小时，再进行细胞贴附式记录。孵育结束后，将含有肾上腺细胞的12毫米盖玻片放入细胞外溶液中。由于使用的是完整的肾上腺组织，下一步需要区分嗜铬细胞与皮质细胞。

在培养中，髓质细胞通常非常明亮，呈棕褐色，并具有近乎完美的圆形形态。相比之下，皮质细胞比CHRO细胞更小且亮度更低。按照文本方案所述方法拉制膜片电极后，将电极尖端浸入熔化的石蜡中，以降低玻璃的电容。

然后将移液管尖端进行火焰抛光，以吹走移液管尖端内部的石蜡。接着用膜片钳移液管溶液填充移液管，使其电阻约为两兆欧姆。将膜片钳移液管固定到操纵器上，并将其移至距离细胞几微米的位置。

继续推进移液管，观察是否有轻微的细胞形变。一旦发现形变，施加轻柔的负压，直至形成吉欧封接（giga ohm seal），获得细胞附着构型。

一旦形成吉欧姆密封，使用EPC 7 plus膜片钳放大器和文本方案中所述的双相模拟锁相放大器进行细胞贴附记录，设置锁相放大器的相位，使轻柔抽吸引起的瞬时电容变化仅出现在膜片电容或Im轨迹中，而不会投影到膜片电导或回扫轨迹中。该封接过程可作为机械刺激。由于动作电流通常可从大多数细胞记录到，因此可通过明显的向下阶跃识别典型的电容变化。

最后一步是保存数据以供后续分析。图中显示的是典型的细胞贴附式电容记录，包含多个向下的阶跃。每个向下的阶跃对应一次单个的iCal内吞事件。

掌握后，细胞培养可在两到三小时内完成，培养建立后的四天内即可进行记录。该技术为突触传递领域的研究人员探索神经内分泌嗜铬细胞中突触囊泡的再循环奠定了基础。