通过噬斑实验测定病毒浓度：传统与新型覆盖系统的应用

本实验的总体目标是通过计数细胞培养中的独立蚀斑来定量具有感染性的病毒颗粒，从而确定病毒浓度。该过程首先将细胞接种，形成致密的单层细胞以用于感染。第二步是对待测的未知病毒样本进行系列稀释。接下来，利用病毒原液的系列稀释液感染已形成单层的细胞，随后覆盖一层固定性覆盖物。最后一步是在针对特定病毒的适当孵育时间后，对蚀斑进行固定和染色，以便计数独立的蚀斑。最终，蚀斑实验可被用于多种不同场景，并可进行相应改进，以测定未知病毒样本的病毒滴度。

与现有的半固体覆盖法等方法相比，该技术的主要优势在于，在高通量和传统应用中，其施加和去除操作都更为简便。此外，该方法无需对试剂进行加热。该技术的应用意义广泛，可推动多种不同裂解性病毒的研究，因为在96孔板中使用液体覆盖层能够快速筛选新型治疗化合物，从而显著减少在实验室中进行传统蚀斑实验所耗费的大量时间。

在检测前一天，接种与所研究病毒相匹配的适当细胞，以确保在感染当天细胞融合度达到90%至100%。储备溶液也可在检测前一天配制。首先，通过将5.56毫升36%的甲醛储备液与14.44毫升蒸馏水混合，配制10%甲醛的固定液。然后配制结晶紫染色液，即含1%结晶紫的20%乙醇溶液，用蒸馏水稀释而成。接下来，在无菌条件下，为所用细胞类型配制适当的2倍浓度空斑培养基。如果任何试剂未经过无菌处理，需通过0.2微米滤膜过滤。为制备空斑实验中使用的液体覆盖层，将2.4克Avicel加入含有97.6毫升蒸馏水的锥形瓶中，并用磁力搅拌器快速搅拌。在室温下搅拌溶液，直至其黏稠度使搅拌子无法继续转动。此时，将锥形瓶转移至摇床，剧烈震荡30分钟，以确保充分均质化。最后，在121摄氏度、14 PSI条件下高压灭菌30分钟。

程序运行结束后，将样品密封并室温保存。对于琼脂糖覆盖层，用蒸馏水配制0.6%的琼脂糖储备溶液，用磁力搅拌器搅拌，并进行高压灭菌以使其完全溶解。对于羧甲基纤维素覆盖层，用蒸馏水配制2%的羧甲基纤维素溶液并混合均匀，然后同上进行高压灭菌。

接种后第二天，使用倒置显微镜检查细胞的融合度和活力，以确定是否可开始实验。确保细胞呈现标准的细胞形态，并达到约90%的融合度。

用细胞培养基对感染性样品进行10倍系列稀释，根据所涉病毒的预期滴度确定所需的稀释倍数。同时准备未感染的对照样品，以独立确认细胞活性，并辅助噬斑的识别。将未感染的对照样品和系列稀释液用移液器加入到培养板的孔中，注意避免破坏单层细胞。

使用足量的接种物覆盖细胞，同时尽量减少体积，以最大化病毒与单层细胞的接触。将培养板放入组织培养箱中，感染细胞45分钟至1小时。每隔20分钟轻轻摇动培养板，以确保接种物均匀分布，并防止细胞单层干燥。

感染期间，准备液体覆盖层的工作溶液。将预热的噬斑培养基与室温的1.2%至2.4%储备Avicel溶液按1:1比例混合，配制成含0.6%至1.2% Avicel的覆盖工作液。对于琼脂糖或CMC覆盖层，将预热的噬斑培养基与加热后的0.6%琼脂糖或2% CMC储备溶液按1:1比例混合。随后置于56摄氏度水浴中，平衡温度30分钟。确保溶液温热但不烫手，以避免细胞死亡及病毒滴度降低。感染完成后，将覆盖层加入感染的单层细胞中。加入覆盖层后，根据所分析病毒的不同，将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育2至14天。

对于带有液体覆盖层的细胞固定，先倾倒或吸除Avicel覆盖层，然后向孔中加入10%甲醛溶液，在室温下固定30分钟至过夜。对于琼脂糖或羧甲基纤维素（CMC）覆盖层，直接将甲醛溶液加入覆盖层中，在室温下固定1小时至过夜。固定完成后，弃去甲醛溶液，然后用刮勺手动移除琼脂糖中的半固体凝胶块。

染色前，用水冲洗Avicel细胞斑块，以去除残留的覆盖固定剂。

用少量结晶紫溶液覆盖细胞，染色约15分钟。如有必要，轻轻摇动培养板以确保染色均匀。用清水轻轻洗去结晶紫染料。固定、染色并干燥后，可将噬斑长期保存以供后续分析。计数每个孔中的噬斑，但排除噬斑数少于5个或多于100个的孔。对同一稀释度的技术重复孔取平均值。注意记录噬斑的大小和形态。通过取某一稀释度下噬斑数的平均值，并乘以总稀释倍数的倒数，计算原始样品的病毒滴度。

该图像展示了利用12孔板进行的裂谷热病毒蚀斑覆盖层比较。将Vero细胞以每孔2.5 × 10⁵个细胞的密度接种于12孔板中，并用相同系列稀释的MP-12起始样品各200 µL进行感染。感染后，直接比较三种覆盖层：0.3%琼脂糖、0.6% Avicel或1% CMC，每孔加入1.5 mL。该直方图显示了三种覆盖层的蚀斑计数与滴定结果。此处展示了利用12孔板进行的委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）蚀斑覆盖层比较。Vero细胞以相同方式接种，并用相同系列稀释的VEEV-TC-83疫苗株样品200 µL感染，感染后同样加入1.5 mL的0.3%琼脂糖、0.6% Avicel或1% CMC覆盖层。

同样，该直方图展示了三种覆盖物进行噬斑计数和滴定的结果。此图像显示了高通量噬斑覆盖的一个示例。将Vero细胞以每孔3 × 10⁴个细胞的密度接种于96孔板中，并使用同一份连续稀释的裂谷热病毒MP-12起始样品，每孔加入50 µL接种物，在四个重复孔中感染1小时。为评估液体覆盖物在高通量条件下的可行性和可重复性，试验了终浓度分别为0.6%和1.2%的Avicel®细胞覆盖物。该直方图显示了从每种覆盖物中测定的病毒滴度。

在进行该实验操作时，重要的是要记住每种病毒各不相同，可能需要进行优化，包括使用不同类型的细胞、孵育时间或培养基。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用液体覆盖法和半固体覆盖法进行基本的噬斑实验。