一种用于家禽生产样品中细菌群落定性与定量评估的混合DNA提取方法

以下实验的总体目标是开发一种新型DNA提取技术，该技术将机械DNA均质化与PCR抑制物去除以及金标准体细胞提取方法相结合，应用于家禽生产连续过程中的环境样品。该方法首先将环境样品分装至含有混合珠粒的微量离心管中，以有效均质化复杂的环境样品；第二步是将这些离心管放入高功率均质仪中，高效释放细菌细胞及环境基质中的核酸。

接下来，将匀浆液作为起始材料，采用金标准的酶法DNA提取方法，经过PCR抑制结合阶段。最后一步是将样品放入DNA提取自动化工作站，从而为用户提供适用于多种下游应用的提取DNA样品。最终通过定量PCR以及使用Illumina MiSeq平台进行微生物组分析表明，与单独使用机械法或酶法提取样品相比，这种新型杂交方法在总细菌群落的定性和定量评估方面提供了最佳组合。该方法有助于分析家禽生产全链条中的微生物群落，也可应用于其他含有类似复杂环境样品的农业系统，如生猪、牛或作物生产系统。

今天由我实验室的学生凯特琳·格里芬（Kaitlyn Griffin）演示该实验步骤。开始实验前，将水浴锅预热至95摄氏度。随后，称取三份0.33克的室温土壤或粪便样品，共计分析一克样品，将其加入2毫升ET裂解基质管中，每处理一个样品后需更换手套。

向样品管中加入825微升磷酸钠缓冲液和275微升预裂解液（PLS）。混匀后，将样品涡旋振荡15秒，然后在14,000 ×g离心5分钟。弃去上清液，加入700微升缓冲液A SL，再将试管涡旋振荡5秒。

每次只打开一个离心管，以防止污染。接下来，在将样品放入Fast Prep 24仪器之前，确保锥形管中留有占总体积10%的顶空空间。以每秒六米的速度对样品进行40秒的均质处理。

注意快速制备24与均质化后涡旋之间的区别。将样品在14,000 G下离心五分钟。将上清液转移至无菌的2毫升微量离心管中，向ET裂解基质管中剩余的样品加入额外的700微升SL缓冲液，重新均质并离心。

使用先前的设置，将塑料锁扣夹固定在样品管上，以确保其不会弹开，然后将上清液置于95摄氏度水浴中孵育5分钟。接着，打开每个微量离心管以释放压力，重新盖紧管盖，并涡旋震荡15秒。以14,000 ×g离心1分钟。

离心后，将1.2毫升上清液转移至无菌的2毫升微量离心管中。然后将含有药片的泡罩包装直接置于打开的微量离心管上方，轻轻将药片从泡罩包装中推入管内。为避免inhibit X药片与管壁接触，每份样品中加入一片inhibit X药片。

接下来，涡旋振荡离心管，直至样品变为均匀的乳白色液体。室温孵育1分钟，然后在14,000 ×g 条件下离心5分钟，注意避免触及管底残留的颗粒物。将全部上清液转移至一支无菌的1.5毫升微量离心管中。

然后以最大速度离心5分钟。在开始自动DNA纯化之前，请确保工作站内含有适量的滤芯吸头和缓冲液。接着，将ellucian管和滤管加入转子适配器中，并向转子适配器的中间槽位分别加入400 µL的各样品。

将转子适配器放入工作站离心机中，并确保所有微量离心管盖子均已牢固固定在转子适配器内。向无菌的 1.5 毫升微量离心管中加入蛋白酶 K 溶液，并将其放入工作站的 A 孔位。将 2 毫升带安全锁的微量离心管加入工作站的振荡部分，并确保样本管的管盖已紧密盖好。

使用工作站上的触摸屏，选择DNA粪便人粪便病原体检测程序，并浏览后续屏幕，以确保工作站已正确装载。所有检查屏幕均通过后，选择“开始”以运行程序。然后从转子适配器中取出样本。

使用基于离心蒸发的系统合并单个样本的三次重复纯化产物。用 Tris-EDTA 缓冲液将样本重新洗脱至终体积为 100 微升。最后，盖紧样本管，并将其置于 -20 摄氏度保存，直至后续分析时使用。

该图表明，机械法在粪便和垫料样本中始终提供了最高的总体细菌标准化基因丰度估计值。在所有情况下，酶法的估计值最低。新型杂交提取法获得了最佳的定性和定量总体细菌群落估计组合。

在测试的三种提取方法中，您现在应该对如何执行这种新型的半自动化杂交DNA提取方法有了更好的理解，并认识到其在复杂环境样品中微生物群落定性与定量评估中的实用性。