将人类视频荧光吞咽研究方法改良用于检测和表征小鼠疾病模型中的吞咽障碍

本实验的总体目标是研究自由活动啮齿类动物的吞咽功能，该方法首先称为视频透视吞咽研究（video fluoroscopic swallow study，VFSS）。首先构建一个喂食室，以在测试期间将啮齿类动物限制在较小的空间内。第二步是使用测试溶液进行行为学训练，以确保动物最大程度地参与实验。

下一步是对预处理后的小鼠进行VFSS检测。最后，对视频进行逐帧分析，以量化吞咽参数。最终，这种新型评估工具可用于在模拟疾病模型中检测和表征吞咽困难，并为临床前试验提供功能性生物标志物。

我们最初提出使用观察室的想法，是因为人类的VFSS检查是自愿且无约束的，我们希望尽可能模拟人类临床检查过程。与现有类似方法相比，该技术的主要优势在于能够快速诱发啮齿类动物的自主进食行为，从而实现对吞咽全过程各阶段的快速检测。通常，刚接触该方法的研究人员在视频分析方面会遇到困难，因为小鼠吞咽动作微小且迅速，难以分辨。

首先组装观察室，然后组装一个注射器递送系统，用于在测试期间向培养皿中递送溶液。组装完成后，将观察室放置在电动剪刀式升降台上，以实现远程定位。使用遥控剪刀式升降台的主要优势在于，可在保持啮齿类动物自由活动的同时，确保其处于透视成像视野中，并提高研究人员的辐射安全性。

通过让小鼠适应观察箱并进行过夜的饮水调控，完成实验前准备。准备就绪后，将观察箱从笼中取出并彻底清洁。使用白板笔在每个清洁后的管子上做好标记，然后将其放回小鼠的饲养笼中。

接下来，制备巧克力味的碘海醇溶液，以建立荧光透视环境。使用备用的观察室和 peg bowl，在荧光透视仪的射线束内确定最佳高度和位置，以便观察动物在侧位平面的饮水行为。将荧光透视的帧率设置为每秒30帧。

如果条件允许，可使用更高的帧率。确保将一个射线不透的校准标记物适当地放置在荧光透视相机上，使其在整个测试过程中在显示器上均可见。此步骤是必要的，以便校准长度测量，从而减少因操作带来的应力影响。

观察笼子，直到一只小鼠自由进入观察室。一旦小鼠进入，将观察室从笼子中提起，并轻轻装上另一端的端帽。经过多次测试，当观察室被放置在笼内小鼠前方，或通过尾巴将小鼠悬吊在观察室开口上方时，小鼠通常会容易地被引导进入观察室。

将观察室置于透视机内，开始在侧位平面进行VFSS检查。接着，使用注射器输送系统将巧克力味的碘海醇溶液注入 peg 碗中。启动视频透视录像。

测试过程中，当小鼠开始饮水时，使用遥控升降台调整观察室的位置，使吞咽机制位于视野中可见。每次小鼠转头离开 peg bowl 时暂停录制，以尽量减少辐射暴露时间。当小鼠返回 peg bowl 时继续录制，并根据需要重新填充 peg bowl。

目标是记录多次长时间的连续饮水行为，这在大多数小鼠中较为典型。在测试开始后的前两分钟内，如果小鼠在五分钟内未饮水，则停止测试，并将不配合的小鼠放回饲养笼，于当天晚些时候重新测试。水剥夺时间不得超过24小时。

对同一饲养笼中的多只小鼠进行测试时，每只小鼠之间需用干燥的纸巾清洁插针碗和导管，并根据需要修剪PE导管的尖端。

若在测试过程中被咀嚼，需根据需要清洁观察室，以清除室壁上飞溅的碘海醇。用自来水冲洗观察室，并用纸巾擦干。使用支持逐帧分析的视频编辑软件对视频透视记录进行分析。

为了量化感兴趣的吞咽参数，至少应由两名经过培训的评审人员以盲法分析每段视频。主要评审人员通过观看每段视频，识别并分析三到五次持续时间较长的饮水过程。该标准基于已发表的非放射性吞咽研究，表明此参数足以进行统计学分析。

随后，第二位评审人独立分析由首位评审人最初确定并分析的每只小鼠每次吞咽参数的三到五个测量值。针对每只小鼠识别出评审人之间的差异，并对这些差异进行重新分析，直至达成100%的一致意见。然后对每个吞咽参数的无争议数值进行平均，以获得每只小鼠的平均值。

当某一吞咽参数的测量值少于三次时，应在统计数据库中对该测量值输入缺失值。这些示例是使用低能量透视系统位置获得的。其中一种方法可实现对整个头部及近端胸段区域的可视化。

吞咽触发点位于视野中央。调整位置，以便从吞咽触发点至胃食管连接处均能清晰可视化。注意，即使在最低放大倍数下，仍可观察到食团通过远端食管。

使用低能量透视系统可以清晰地观察到头颈部的骨性结构。此外，通过更高倍数的放大来检查解剖结构，以便量化其他多个吞咽参数。该图展示了两次VFSS吞咽参数的代表性初步结果，即吞咽频率和吞咽间歇。与老龄C57小鼠相比，SOD1小鼠的吞咽频率显著减慢。

小鼠与对照组之间的吞咽间隔无显著差异。若操作得当，掌握该技术后，每次样本的视频采集可在不到两分钟内完成。在实施该操作时，需注意巧克力味测试溶液应在配制后数小时内使用，以防止黏度和适口性发生变化，从而导致回避行为。

这一新技术为神经科学领域的研究人员探索健康啮齿类动物及疾病模型中的自然摄食与吞咽行为铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何成功地对自由活动的啮齿类动物进行VFSS检测，以量化典型的摄食行为和吞咽功能。请务必注意，使用能发射辐射的设备可能具有极高危险性，在执行该操作时，必须始终遵循关于时间、距离和屏蔽的辐射防护措施。