基于绿色荧光蛋白的膜蛋白表达筛选 大肠杆菌

本实验的总体目标是鉴定在 SIA 大肠杆菌中表达的膜蛋白，以进行结构与功能分析。首先，收集细菌，裂解后通过 SDS-PAGE 电泳分析，并利用凝胶荧光法观察正确折叠的 GFP 蛋白。第二步，扩大表达目标膜蛋白的大肠杆菌的培养规模，并在诱导蛋白表达后，从细胞中制备总膜组分。

最后，将总膜组分分别溶于四种不同的去垢剂中，并通过尺寸排阻色谱分析去垢剂溶解后的GFP蛋白的单一分散性。最终，可通过荧光检测这些蛋白，并绘制洗脱曲线，以评估样品中蛋白的聚集情况、单一分散性以及游离GFP的存在。

由于膜蛋白的溶解度较低，且在提取到去垢剂中后具有固有的不稳定性，因此制备用于结构与功能研究的重组膜蛋白在技术上仍具有挑战性。已有经验表明，筛选来自不同物种的膜蛋白多种变异体（例如直系同源蛋白），可提高膜蛋白表达的成功率。融合绿色荧光蛋白可用于报告膜蛋白的正确折叠状态。

在基于GFP的膜蛋白表达筛选实验方案中，第一步是利用全细胞去垢剂裂解物的凝胶内荧光，鉴定出表达水平符合进一步分析要求的膜蛋白构建体。随后通过荧光检测结合尺寸排阻色谱法，评估所选膜蛋白与不同去垢剂的作用行为，从而获得去垢剂-蛋白复合物单分散性的相关信息。为分析IPTG诱导的细菌表达，首先将24孔深孔板中过夜培养的IPTG处理的大肠杆菌一毫升等分试样转移至96孔深孔板中，密封深孔板后，在室温下以6,000 × g离心10分钟，使细胞沉淀。

随后，将培养块倒置，轻轻在纸巾上轻敲以倾倒培养基并沥干残留液体。再次密封培养板，并在至少20分钟后将细胞置于-80摄氏度保存。在室温下解冻沉淀物20分钟，然后使用多通道移液器将细胞完全重悬于200 µL裂解缓冲液中。

将细胞与20微升DLPI溶液在1000 RPM、4摄氏度条件下振荡处理10分钟。然后向每孔加入25微升10% DDM（十二烷基麦芽糖苷）溶液，继续振荡孵育60分钟。DDM处理后，离心深孔板，随后将10微升澄清裂解液转移至微量滴定板中，并加入10微升SDS-PAGE凝胶上样缓冲液。

现在每孔加入10 µL裂解缓冲液，然后在低温室中以100至120伏恒定电压电泳运行2至2.5小时，直至溴酚蓝迁移至凝胶底部。将凝胶置于带有蓝色光滤光片的成像仪上，以检测融合蛋白，从而扩大细胞培养规模。在将Eloqua转化入感受态大肠杆菌后，挑取单菌落接种于10 mL Power Broth培养基中，在37°C下过夜培养。

第二天早晨，将5毫升过夜培养物稀释至500毫升强力肉汤培养基中，继续在37摄氏度、250 RPM振荡条件下培养。当595纳米处的OD值约为0.5时，加入IPTG至终浓度为1毫摩尔，诱导表达，然后将培养物放回摇床，于20摄氏度过夜培养。第二天早晨，通过离心收集细胞，并将菌体沉淀储存在负80摄氏度。

为制备细胞膜，将第三个室温沉淀物按每克细胞沉淀加入五毫升磷酸盐缓冲液（PBS）重新悬浮，根据需要增加体积，直至黏度降低至流动状态。然后向细胞中加入氯化镁，使其终浓度为一毫摩尔（1 mM）；加入脱氧核糖核酸酶（DNase），使其终浓度为每毫升十微克（10 µg/mL）；并按每二十克细胞沉淀加入一片预包装的蛋白酶抑制剂片剂。

接着，使用预冷的细胞破碎仪在30 KPSI的压力下裂解细胞，然后在30,000 × g、4°C条件下离心15分钟，沉淀未破碎的细胞和碎片。将上清液转移至超速离心管中，在200,000 × g、4°C条件下离心1小时，收集总膜组分。然后使用细胞匀浆器将膜沉淀物重悬于10 mL冰预冷的PBS中，以便对每种待用的去垢剂溶解膜结构。

取900微升膜悬液分装至1.5毫升聚丙烯离心管中。然后向各1.5毫升离心管中加入100微升 freshly prepared 去垢剂，并在4摄氏度下轻轻振荡孵育混合物。一小时后，使用台式超速离心机离心收集去垢剂和可溶性组分，确保离心管至少半满，并保留上清液用于荧光检测尺寸排阻色谱或FEC分析。

接下来，使用一根具有宽分离范围的等度尺寸排阻色谱柱，并以每分钟0.3毫升的流速运行流动相缓冲液。然后，在相同流速下将100微升溶解的膜样品注入色谱柱，并利用荧光光学系统监测洗脱曲线。最后，将洗脱体积和荧光强度数据导入电子表格程序进行图形化展示，并通过凝胶内荧光分析剩余的溶解膜材料。

如前所述，这类蛋白质家族对细菌细胞分裂至关重要。在这些图像中，展示了47种所述构建体中24种的凝胶内荧光可视化代表性结果。条带的强度可反映表达水平的高低。

例如，第4泳道中的融合蛋白在两种菌株中均表达良好。然而，额外出现的较低分子量条带表明该蛋白在多个泳道中发生了部分降解。其中有一条带的大小与单独的GFP相对应。

例如，在 C41(DE3)pLysS 菌株中，G4 和 H4 完全降解为游离的 GFP；而在 LEMO21(DE3) 菌株中，这些图谱显示仍有部分完整蛋白存在。通过对初筛中表现良好的两个构建体进行荧光检测的尺寸排阻分析，可以揭示这些蛋白在四种不同去垢剂处理下的行为差异。

例如，该蛋白在Dool Multiside中仅表现出一个对称的峰，且聚集较少，因此成为后续纯化的首选去垢剂。相比之下，另一种融合蛋白在所有测试的去垢剂中均表现出相似的图谱。本方案可轻松扩展，例如纳入在不同表达条件下培养的不同大肠杆菌菌株，以及在初筛和次筛中加入更多的去垢剂。

总之，本实验方案的主要目的是对大量膜蛋白的表达及去垢剂处理条件进行筛选，以鉴定出适用于进一步分析的候选蛋白。