逆转录病毒复制载体转导的非黏附性同种反应性T淋巴细胞的径向迁移能力与细胞毒性功能

以下实验的总体目标是展示非黏附性效应T淋巴细胞在黏附性肿瘤细胞单层上的迁移过程。首先，在聚-D-赖氨酸包被的聚四氟乙烯掩膜载玻片的孔中建立一层黏附性肿瘤细胞单层；第二步，使用细胞沉降装置将荧光标记的效应T淋巴细胞沉降到单层中央；随后通过明场和荧光显微镜观察非黏附细胞在单层上的迁移情况。

结果表明，在与贴壁肿瘤细胞单层共培养的条件下，经逆转录病毒载体转导后的非贴壁T淋巴细胞仍能维持其迁移能力和效应功能。该技术相较于现有方法的主要优势在于，可在与贴壁肿瘤细胞共培养体系中定量测定非贴壁效应T淋巴细胞的径向迁移能力。这一发现对于原发性或转移性脑肿瘤患者具有深远意义，因为目前正将经基因修饰以表达前药激活酶基因（如胞嘧啶脱氨酶）的同种异体细胞毒性T淋巴细胞，作为一种多模式联合疗法用于清除脑内肿瘤的探索之中。

通常，初次接触该方法的研究人员在建立贴壁肿瘤细胞单层时会遇到困难，这是由于肿瘤细胞在贴壁生长特性上具有异质性。本方法的可视化演示至关重要，因为要获得均匀的肿瘤细胞单层以及有效沉淀非贴壁的 L-O-C-T-L 细胞，需要对这两类细胞的特性具备熟练的理解。首先，可放置最多四个已灭菌的。

在无菌的150毫米×15毫米培养皿中放置10孔聚四氟乙烯（Teflon）涂层载玻片。在载玻片旁放置一个35毫米×10毫米的培养皿，内含2至3毫升无菌水，以提供湿度环境。接下来，用含有100微克/毫升的多聚D-赖氨酸（poly D-lysine）或多聚L-赖氨酸（poly L-lysine）溶液覆盖每个孔，对载玻片进行预包被处理。

将切片在室温下孵育一小时，然后吸除溶液，并用PBS冲洗孔表面两次（使用已制备的样本孔）。收集一个融合的贴壁肿瘤细胞培养瓶中的细胞。通过光学显微镜计数活细胞数量，然后将细胞重悬于浓度为每毫升5×10⁶个细胞的溶液中。

在缓冲培养基中，根据肿瘤细胞类型，向每孔加入 5 至 10 微升细胞悬液，用培养基将每孔体积补至 40 微升，并缓慢吹打混匀，使细胞均匀分布。接种完成后，将培养板在室温下静置 30 分钟，使肿瘤细胞沉降。随后盖上培养皿盖，小心转移至含 5% 二氧化碳、37 摄氏度的湿润培养箱中，孵育至少 24 小时。

每天更换培养孔中的培养基，小心移除单层细胞中的部分培养基，并加入更大体积的新鲜完全T细胞培养基。通常在1至3天内细胞即可达到汇合状态，以准备将细胞沉降至肿瘤细胞单层上。在进行检测前至少一小时，收集非贴壁的T细胞，并根据制造商说明书用细胞增殖染料进行标记。

接下来，将装有肿瘤细胞玻片的湿化腔室放入生物安全柜中。用移液器吸取 PBS 清洗各孔，然后向各孔中加入 45 µL 含 10% 血清的完全培养基。将一个已灭菌的细胞沉降多通管架缓慢滑过各孔，直至管架末端的钩子接触玻片底部。

确保培养基在多通道装置中可见。然后计数非贴壁细胞，并将其重悬于培养基中，浓度为每微升含1至2×10⁵个细胞。

轻柔地分散细胞，以消除可能干扰细胞沉降的细胞团块。将细胞悬液逐滴缓慢加入多通道装置的每个通道中，每孔加入一微升。随后将装置在室温下孵育20至30分钟，使通道中的细胞沉降到单层细胞上。

待细胞沉降后，轻轻垂直提起多通道装置，切勿触碰玻片。确保细胞沉淀已位于多通道装置通道的范围内。在显微镜下观察，已沉降的细胞应轻微贴附于单层细胞上，轻移玻片时不会使沉淀散开。

确认细胞已沉降后，将载玻片转移至配备二氧化碳和湿度培养室的倒置显微镜上。使用4倍物镜对细胞进行明场和多通道荧光成像。在明场和荧光通道中采集特定区域的图像，然后使用图像采集软件添加微米标尺。

在获取所有时间点的数据后，将载玻片存放在加湿的培养箱中。将图像文件拖放到图像编辑软件中，并选择添加图层选项，以创建包含多个图层的图像文件。将明场图像与荧光图像合并到同一图层中。

使用采集软件拍摄一个8毫米×8毫米区域的图像。软件应设置为自动拼接所捕获的图像，并选用在整个孔内成像效果最佳的通道进行拼接。如果仅对荧光通道进行成像，则应使用用于成像贴壁细胞的通道。

或者，可以使用图像编辑软件进行图像拼接。该过程通过将不同图像之间保持不变的区域对齐，并将图像相互叠加，直至生成一幅完整的图像。使用图像软件将这些图像拼接在一起。

使用组合图像，通过 Image J 软件生成表面强度荧光图，以可视化随时间推移的荧光 T 细胞聚集或扩散情况。已知的人类同种反应性细胞毒性 T 淋巴细胞（Allo CTL）经转导，携带编码翡翠绿色荧光蛋白表达基因的复制型逆转录病毒载体，将其置于胶质瘤细胞单层的中央。4 小时后，Allo CTL 在 24 小时内已形成可见的聚集体。

在贴壁细胞单层中出现空斑，表明肿瘤细胞发生裂解，部分异基因CTL已迁移至边缘以外。在1小时时，荧光标记的小鼠异基因CTL位于荧光标记胶质瘤细胞单层的中央；至48小时时，异基因CTL已与胶质瘤细胞紧密接触，并从单层表面的中心区域迁移出去。通过ImageJ软件对这些图像生成荧光分布图，显示48小时后细胞已显著从中心区域迁移。

每天更换肿瘤细胞单层的培养基至关重要，以维持良好的培养条件。此外，掌握该操作后，非贴壁细胞的沉降过程大约需要 20 分钟。还可采用其他方法，例如细胞路径追踪，以研究同种异体 CTL 穿越单层的迁移速率，或其与肿瘤细胞接触并执行细胞毒性功能所持续的时间。

本实验方案将帮助免疫基因治疗领域的研究人员探索基因修饰的T淋巴细胞在与肿瘤细胞共培养时的迁移行为。观看本视频后，您应能充分掌握如何制备用于共培养的非贴壁细胞和贴壁细胞，以及如何利用细胞沉降装置研究非贴壁细胞在肿瘤细胞单层上的水平径向迁移。