清醒大鼠经口给予味觉刺激物期间利用快速扫描循环伏安法检测多巴胺快速动态变化

本实验的总体目标是测量对高浓度口腔味觉刺激的亚秒级多巴胺反应。首先制备用于手术及后续快速扫描循环伏安遥测记录所需的口腔导管、参考电极和碳纤维电极；第二步是通过手术植入口腔导管、颅内电极以及用于碳纤维电极的导向套管。

一周后，可将碳纤维微电极插入伏隔核，以记录在经口给予味觉刺激时细胞外多巴胺释放的变化。记录完成后的最后一步是校准电极，并利用主成分分析法分离出包含多巴胺信息的数据。最终，结合经口味觉给予与快速扫描循环伏安遥测技术，用于揭示多巴胺在亚秒级时间尺度上对味觉刺激的响应变化。

与现有方法相比，这种联合技术具有两个主要优势。首先，快速IC光度法具有高时间分辨率；其次，通过口腔内递送taten可最大限度减少大鼠获取tatin所需的动作，从而帮助我们更准确地分离出对tatin的多巴胺反应。通常，初次接触该方法的研究人员在口腔导管的制备方面会遇到困难。

然而，制作一个合适且经过付费优化的口腔导管，可确保导管紧密贴合于颊部与上部磨牙之间，从而提高实验成功的可能性。首先准备记录电极：将一根直径为七微米的T650碳纤维吸入内径为0.4毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管中。接着，将毛细管置于垂直电极拉制仪中，初始拉制时将加热器设定为55.0，磁体关闭，随后根据需要进行调整。

在显微镜下拉制移液管后，剪切暴露的碳纤维，使其超出玻璃管末端75至100微米。碳纤维在玻璃管内必须密封紧密，否则应弃用该制备样品。接下来，剥去一根3英寸长、30号导线一半长度的绝缘层，并使用热缩管将电极固定至显微操作器上。

当银漆仍处于湿润状态时，在导线上涂覆一层薄薄的银漆。将导线插入电极的开口端，并将其与其中的碳纤维连接。在显微镜下验证此连接接触是否良好。

使用显微操作器夹持电极，并用热缩管固定。将制备好的碳纤维电极放入异丙醇（IPA）中至少10分钟，以清洁电极表面并提高后续对多巴胺的检测灵敏度。从异丙醇中取出电极后，用自来水冲洗碳纤维，以去除残留的异丙醇。

接下来，使用一根长13毫米的银丝制备参比电极，该银丝一端带有直径为0.4毫米、尺寸为6毫米的银/氯化银网状结构。剪除银丝上无网状结构的部分，并将其焊接到金针上。然后在焊点处涂覆环氧树脂。随后将网状部分浸入共聚物酸中五次。

最后一次浸渍后，每次浸渍之间在空气中干燥30分钟。然后让其过夜自然干燥。第二天。

将金属丝的网状部分在 120 摄氏度下烘烤一小时。制作口腔导管时，先将聚乙烯 100 导管切成六厘米长的节段。

然后将管段的一端熔化，并在圆盘中心处压到一个平坦的冷却表面上，形成一个小型的扁平圆盘。使用18号针头打孔。将管段的另一端连接到18号钝头针头的末端。

然后使用打孔器制备数个直径为6毫米、厚度为3.18毫米的聚四氟乙烯圆片。接着在这些圆片的中心位置打孔，使其成为垫圈状。将垫圈切割成梯形，以便在磨牙植入过程中固定其位置。

完成导管制备时，将连接聚乙烯（PE）导管的针头完全穿过垫圈，并将垫圈沿导管滑动至与导管端面平齐。以下实验方案约需75分钟完成。开始时，取一只已做好手术准备的大鼠，使用棉签将其口腔打开。

然后将套管针的针头插入颊部与第一上臼齿之间的组织，使针头从耳后稍内侧穿出。接着向上移动套管，将垫圈固定在臼齿上，以稳定导管并使其固定在暴露的针头上。滑上一个垫圈，并将其紧贴切口。

将此垫圈固定到位。修剪导管，使其在大鼠头部上方露出 2 至 4 厘米。然后采用相同技术，将导管插入另一侧口腔。

随后，将大鼠放入立体定位仪框架中，并钻出三个孔，用于插入套管和电极，以在伏隔核核心区域进行记录。导向套管位于前囟前1.2毫米，外侧1.4毫米处。

将套管装置缓慢下降，直至塑料基座与颅骨表面齐平。将参考电极置于与引导套管对侧的大脑半球。将参考电极下降至硬脑膜下方约两毫米处。

然后将刺激电极置于视上裂后方 5.2 毫米、外侧 1.0 毫米处，以定位腹侧被盖区。将刺激电极下降至硬脑膜下 8.0 毫米处。

然后用螺钉和粘固剂固定组件，并进行术后护理。在开展实验前，务必通过注入 200 µL 水来验证口腔套管的通畅性，并观察大鼠是否尝到水；通过移除假性套管，向其中加入两滴 50% 肝素，然后轻轻重新放置，以清洁记录位点。假性套管距离记录位点不得超过 2 毫米。

现在将头戴装置连接并固定到植入VTA的刺激器上，然后将记录电极插入伏隔核核心。随后按照文本方案生成训练数据集。每次刺激之间务必等待至少两分钟，最长可达四到五分钟，以允许囊泡重新装载。

实验中最关键的步骤是获得高质量的电极。如果背景在上升阶段呈现特征性的圆润形状，则表明电极为优质。如果圆润形状较小或与施加的波形非常接近，则应尝试更换不同的电极。

如果背景电位发生偏移，则以0.1伏为增量，向正方向对施加的波形应用偏移校正。在记录位点生成训练集后，以每1至3分钟注入200微升塔滕溶液的方式，共进行25次注入，同时采集数据。随后等待至少30分钟，再以相同方式注入下一种味觉刺激物。

采用FSCV结合口腔内导管植入技术，用于研究蔗糖在给予之前如何调节伏隔核核心部位的时相性多巴胺释放。VTA给予电刺激（以红条表示）在训练完成后，可显著增加伏隔核核心部位的时相性多巴胺释放。持续6.5秒、体积为200 µL的蔗糖灌注（以红条表示）引起电流升高（以白色箭头指示），该信号出现在多巴胺的氧化电位处（以白色虚线表示）。将数据转换为浓度-时间曲线图后，经主成分分析（PCA）验证，确认味觉刺激引起的电流增加确实源于多巴胺浓度的升高。

在伏隔核核心进行FSCV记录期间，另一种塔亭（tatin）薄荷醇灌注也观察到多巴胺浓度升高。一旦掌握，这种联合的经口内和套管手术可在75分钟内完成。该技术可与其他行为范式结合使用，例如竞争性和厌恶性经典条件反射和操作性条件反射，以探究在这些过程中亚秒级多巴胺信号传递的相关问题。