单链DNA瓦片自组装形成复杂的二维结构

以下实验的总体目标是利用单链DNA瓦片构建复杂的DNA纳米结构。该过程通过将精心设计的合成DNA链在特定缓冲溶液中混合，以在第二步中形成目标DNA纳米结构。样品在退火过程中发生结构的自组装。

接下来，进行天然琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜成像，以验证纳米结构的成功形成。结果表明，通过天然琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜成像，DNA纳米结构已基于指定序列实现了自组装。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为此类自组装的样品制备过程看似较为复杂。在开始此实验步骤之前，需从寡核苷酸供应商处获得溶解于无RNA酶水中的指定序列DNA组分链，并将其置于Vbo 96孔板中；随后用移液器从362个孔中每个孔吸取一微升溶液，用于24根螺旋、28圈的结构组装。

将每条链100微摩尔加入一个2毫升的试管中。然后向试管中加入138微升去离子蒸馏水，配制成每条链浓度为200纳摩尔的储备液。

向一个0.2毫升的PCR管中加入50微升200阿摩尔的储备溶液、10微升10×退火缓冲液A以及40微升蒸馏去离子水。随后，在热循环仪中将样品退火17小时，温度从90摄氏度降至25摄氏度。

制备含 SYBR Safe 预染色的天然 2% 琼脂糖凝胶后，将其置于冰水浴中，以 100 伏电压电泳运行两小时。电泳结束后，使用配备适合 SYBR Safe 染料检测滤光片的凝胶成像系统，在蓝光透射仪上成像，并用锋利洁净的剃须刀片切下与 1 千碱基 DNA Ladder 中 1,500 碱基对条带迁移率相近的主条带。将目标凝胶片段放入离心柱中，用微量离心管压碎器将凝胶碾碎成细小碎片，随后在 4 摄氏度下以 438 ×g 离心 3 分钟。

离心后，使用紫外分光光度计在260纳米处测定DNA的浓度。此时，用透明胶带剥离附着在样品金属圆盘上的云母片，以获得一个平整的表面，并将样品圆盘放置在显微镜的成像载物台上。

加入40 µL的1×跪立缓冲液A，随后加入5 µL纯化的24 HELOCs样本（经28次矩形循环处理），置于新裂解的Micah表面。让混合物静置约两分钟。将AFM氮化硅悬臂芯片安装到悬臂支架上，在液体轻敲模式下对样本进行成像，扫描尺寸为2 µm，分辨率为1024线。

内部标记的扫描速率为每秒0.5至1赫兹，该标记连接于矩形的3'端17个核苷酸片段、8个内部瓦片和6个边界瓦片。将28条带手柄的链与24个HELOCs其余组分链在28转矩形中混合，制备用于边界标记的200纳摩尔浓度储备液。将14条带手柄的链与24个heel seas其余组分链在28转矩形中混合，获得用于内部标记的200纳摩尔浓度储备液。

进行边界标记时，向一个PCR试验管中加入50 µL的200 nmol/L储备溶液、60 µL的100 µmol/L生物素修饰的反向链、10 µL的10×退火缓冲液A以及34 µL的去离子蒸馏水。

进行内部标记时，向PCR试管中加入50微升200纳摩尔的储备溶液、3微升100微摩尔的内部抗手柄生物素修饰链、10微升10×退火缓冲液A以及37微升去离子蒸馏水。

随后，将0.06克尿素甲酸盐溶于3毫升蒸馏水中。为配制2%的尿素甲酸盐水溶液染色液，使用连接在注射器上的0.2微米滤器过滤染色液。向1毫升过滤后的染色液中加入5微升5摩尔/升的氢氧化钠溶液。

将溶液短暂涡旋后，在20,000 G条件下离心。使用以下参数对碳膜载网进行辉光放电处理，使有碳膜的一面朝上。处理完成后，用移液器吸取3.5 µL样品滴加到经辉光放电处理的载网上。四分钟后，从侧面将滤纸接触载网，利用毛细作用将样品吸除。

立即在载网上加入 3.5 µL 染色液。一分钟后，用滤纸吸去染色液，并将滤纸紧贴载网持续一到两分钟。将载网转移至透射电镜样品台。

使用 A-J-E-O-L GM 1400 在 80 千伏电压下操作获得的图像，放大倍数范围为 10 K 至 80 K。确定形状后，选择与分子画布上该形状相对应的链段。用一段 10 到 11 个核苷酸长度的多聚 T 片段替换暴露的结构域，或添加一段与暴露结构域互补的边缘保护链，并在其末端接上一段 10 到 11 个核苷酸长度的多聚 T 片段。为防止聚集，为包含束腰结构的 310 像素分子画布构建一个链段文库。

将一组星号、二组星号、三组星号和四组星号组合，共得到 1,344 个边缘保护剂。将不同组别的 96 孔板离心后，从核心组中移取 1 微升 206 条链，从一组星号中移取 0 条链，从二组星号中移取 0 条链，从三组星号中移取 0 条链，从四组星号中移取 24 条链，加入至一个 2 毫升离心管中。向该管中加入 20 微升蒸馏去离子水，配制成 400 纳摩尔的 DNA 链储备溶液。

接下来，向一个0.2毫升的PCR管中加入50微升400纳摩尔的母液、10微升10×退火缓冲液B以及40微升去离子蒸馏水，并按照之前所述方法在热循环仪中孵育17小时。样品纯化后，测量DNA浓度，并以与之前相同的方式使用FM对样品成像，最后通过简单改变平行六螺旋的数量和螺旋圈数来构建不同尺寸的矩形结构。

单链瓦片的自组装将产生一个由24个HELOC和28个转角组成的矩形DNA序列。通过修改和优化不同单链瓦片的序列，可实现链的分裂与标记，并将矩形转化为管状结构。已测试了可编程的单链瓦片自组装方法，以形成不同尺寸的管状和矩形结构，并利用分子画布构建二维任意形状。针对任意形状中暴露结构域的聚集问题，测试了结构域替换设计和边缘保护设计两种解决方案。两种设计在凝胶产率和结构完整性方面表现相当，但边缘保护设计更具成本效益，因其所需的辅助物种更少。

观看本视频后，您应能充分理解如何基于单链瓦片构建复杂的DNA纳米结构。