利用自动化图像处理方法对小鼠社交行为的实验评估

这些行为学实验与自动分析相结合的主要目标是以高效利用时间的方式定量评估小鼠的社会性行为。该方法有助于在已验证的自闭症谱系障碍小鼠模型中快速筛选可增强社会性的药物。引入自动分析的主要优势在于能够加快实验进程，从而提高筛选效率。

开发一种自动化方法来评估小鼠社交行为的需求源于：对候选化合物的单次剂量进行实时视觉筛选需要超过50小时。在视频的稍后部分，我的研究生Frency Varghese将演示自动化分析过程。首先准备一个三室结构的黑色壁面笼具。

在第一次实验时，将一个空的倒置金属丝杯放置在笼子每个末端的隔间内。现在将视频摄像机调整至从上方观察笼子的位置，确保三个隔间均能被拍摄到，分辨率为至少 720 × 480 像素。

然后使用间接的白炽灯光照照亮笼子，使从笼底测量的笼内照度不超过 3.5 Lux。同时提供红外光，使笼子的照明程度足以被相机检测到。拍摄一张空笼子的单帧图像作为参考。

首次实验时，将测试小鼠放入笼中。随后，仅用手在笼子上方挥动一次，以触发视频的自动分析程序。让小鼠在测试笼中自由探索10分钟。

然后将其放回原来的笼子中。在第二次实验时，将刺激小鼠放置在两个倒扣杯子中的其中一个下方，杯子的选择应采用交叉平衡的方式进行。

在软件中指明将刺激小鼠放置于哪个杯子下方。根据命名规范，放置有围栏内小鼠的杯子称为社交杯，另一个杯子则称为非社交杯。隔间也采用类似的命名方式。

像第一次实验一样，用手势示意第二次实验阶段的开始。在第二次实验阶段结束时，移除倒扣的杯子以释放第二只小鼠。再用手势示意第三次实验阶段的开始，让两只小鼠在测试笼内相互接触10分钟。

10 分钟后，将两只小鼠放回各自的饲养笼中。本节介绍如何使用用户界面处理视频。此外，也可采用无需用户输入的快速批量分析模式。

首先使用“加载”按钮载入视频，然后选择笼具构型。分析程序将自动识别笼具的边界、区域和杯状结构。

选择四种预设配置之一，或手动调整坐标。现在对视频的每一帧执行以下处理步骤：首先将帧转换为灰度图像。

第二步，减去准备阶段拍摄的灰度参考帧，从而使除小鼠位置外所有区域的像素值归零。第三步，通过将亮度高于设定阈值的所有像素设为白色，其余像素设为黑色，对图像帧进行二值化处理。根据实际光照条件调整该阈值参数。

现在使用腐蚀/膨胀功能从图像中去除尾部。首先将二值化图像腐蚀三次，然后将图像膨胀六次。

然后将帧再腐蚀三次。如果使用不同的像素分辨率，可能需要进行调整。手部挥动很容易被识别为白色像素体积的大幅跃升。

这可以实现对会话开始和会话顺序的自动检测。在每次会话中，使用 L/Comp 命令检测白色像素的最大连通组分，以消除不属于小鼠的像素。

然后使用“查找端点”功能，确定最大白色像素区域中距离最远的两个像素点，即鼻端和尾端。软件将计算该白色像素目标的重心（COG），并据此计算其逐帧的运动方向。

对于包含两只小鼠的实验，必须同时追踪两个物体。使用相同的命令集选择并定位面积最大的两个白色像素物体。软件会自动逐帧检查这两个物体的重心（COGs）。

如果任一物体的尺寸变化超过20%，或质心移动距离超出小鼠可能达到的范围，则二值化阈值将自动提高，直至满足这些条件。软件会自动逐帧检查质心位置。如果任一物体的尺寸变化超过20%，或质心移动距离超出小鼠可能达到的范围，则二值化阈值将自动调整，直至满足这些条件。

当物体之间的距离在两厘米以内时，系统会自动检测到相互作用。这些片段将回放以供用户输入。对每个片段，根据测试小鼠的视角标注为“社交回避”、“社交接近”或“无”。

为验证自动分析结果，请使用“加载”按钮载入视频，然后点击“开始第1个会话”以显示该会话的第一帧。使用“播放/停止”命令控制视频播放。

处理后的视频中，每只小鼠的头部和尾部均以不同颜色的圆圈标记。同时，社交行为测量指标会在播放过程中实时显示并更新。请修正自动分析过程中遇到的任何错误。

最常见的错误是头尾颠倒，可通过界面上的工具进行修正。这种情况大约出现在 20% 的视频中。对于极少数更复杂的错误，通常可以通过手动标记小鼠鼻部在特定连续视频帧中的位置来解决。

确认无误后，使用导出功能以电子表格格式导出社交行为数据。若要将多个视频的数据合并导出为单个电子表格，需先将这些视频文件置于同一文件夹中，然后使用“编译数据”功能完成操作。在第一次实验中，一只四周大的BALB/c测试小鼠在10分钟内于不同区域之间移动了59次。

小鼠在每个区域所花费的时间被视为在无社交刺激条件下对区域偏好的基线。在第二次实验中，呈现一个社交杯和一个非社交杯，其中隐藏一只四周龄的ICR小鼠。小鼠明显倾向于在社交区域花费更多时间。

具体而言，小鼠在社交杯旁停留的时间长于非社交杯旁。在第三次实验中，移开杯子，允许小鼠进行互动。在10分钟内，共发生了35次社交接近行为。

该技术开发后，可加快对有望改善自闭症谱系障碍小鼠模型核心症状——社交障碍的药物进行快速筛选。自动化处理方法可适用于不同的笼具设计和物种。只要能够开发出可靠检测特定行为的算法，任何目标行为均可被评估。