淋巴细胞微颗粒的制备及其对气道上皮细胞促凋亡效应的检测

本实验的总体目标是展示从T淋巴细胞系体外生成淋巴细胞微颗粒（LMPs）的方法，并证明其对气道上皮细胞的促凋亡作用。首先通过制备LMPs来实现该目标，随后利用流式分析对分离得到的LMPs进行表征。

然后对支气管组织外植体进行培养。最后对支气管外植体实施LMP处理。最终，通过苏木精-伊红染色以及NC两种细胞死亡检测等组织病理学检查，来显示LMP诱导的支气管上皮层损伤及上皮细胞凋亡。

与现有的从人外周血中分离微颗粒的方法相比，该技术的主要优势在于，我们能够在体外大规模生成来源于细胞系的微颗粒。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为支气管外植体培养的关键步骤不易制备。开始培养前。

将CEMT细胞接种于四个T175培养瓶中，每个培养瓶加入150毫升新鲜培养基，在37°C培养至细胞密度达到每毫升200万个细胞。通过以200 × g离心5分钟收集每个培养瓶中的细胞，并将300 × 10⁶个细胞重悬于含150毫升新鲜培养基的新T175培养瓶中。为维持每毫升200万个细胞的密度，向培养基中加入37.5 µL放线菌素D，使其终浓度为0.5 µg/mL，并在37°C孵育24小时。

将所有培养基转移至50毫升锥形管中，在750 × g条件下离心5分钟以沉淀细胞。然后将上清液转移至50毫升锥形管中，在1500 × g条件下离心15分钟，以去除较大的细胞碎片。接着将上清液转移至250毫升离心瓶中，在12,000 × g条件下超速离心50分钟。

然后弃去上清液，收集沉淀。用40毫升无菌PBS在50毫升离心管中洗涤LMP富集的沉淀，于12,000 ×g离心50分钟。重复此步骤两次。

取最后一次洗涤的上清液，加入一毫升 PBS 作为阴性对照。将沉淀重悬后转移至 1.5 毫升无菌微量离心管中，分装后将分离得到的 LMPs 在 -80 摄氏度保存。为通过流式分析表征微颗粒，首先准备两份膜联蛋白缓冲液，其中一份含有氯化钙，另一份不含氯化钙。

在离心管中，将一微升LMPs加入含氯化钙的44微升Nexin缓冲液中稀释。另取一管，使用不含氯化钙的Nexin缓冲液。随后，向每管中加入五微升X和V sci five，充分混匀，室温避光孵育15分钟。

孵育后，使用 400 微升 Fax Flu 鞘液。为终止反应，在每管中加入 10 微升 7 微米计数微球悬浮液作为内参标准。为获得绝对计数，需在流式细胞仪上根据相对大小、FSC-H 和相对颗粒度 SSC-H 设定已建立的门控，并绘制点图。

使用直径为一微米的尺寸校准荧光微球作为门控一，并以七微米的微球进行计数。对于门控二，在F-S-C-H-S-S-C-H图上利用已建立的门控和FL4通道分析LMP样本，通过annexin点图采集信号，直至门控二中计数微球达到10,000个；确定在含有氯化钙的annexin缓冲液中LMPs的阳性外泌体（ex NV）事件数，并减去在不含氯化钙的annexin缓冲液中LMPs的事件数。根据以下公式计算LMPs的绝对数量。

使用手术刀、杜蒙超细镊子和手术剪无菌解剖肺组织。小心去除肺实质和血管。将支气管浸入组织洗涤液中进一步解剖，并分离出直径为1至2.5毫米的支气管与外周肺组织。

使用手术刀，在无菌弯头显微解剖镊的刮取动作辅助下，将支气管组织切成约五毫米厚的支气管条状片段。拾取支气管组织碎片，并将其放置于先前已划痕处理的培养皿区域上。根据文本方案，移除组织清洗液，将组织碎片在室温下孵育约五分钟，以使其贴附于培养皿表面。

向每个培养皿中加入10毫升完全愈合培养基，将其放入含有高氧气体混合物的可控气氛模块化培养室中，冲洗培养室后，置于台式轨道摇床中，在37°C下以每分钟10个循环的速度振荡24小时，使培养基间歇性流过组织碎片。培养结束后，在相差倒置显微镜下观察组织外植体，选择具有完整纤毛运动和活跃支气管上皮的支气管外植体用于后续LMP处理。

处理LMPs时，计数刚选好的支气管外植体，并标记12孔组织培养板的每个孔。对每个外植体，将0.5毫升完全生长培养基转移至无菌Eppendorf管中。然后，每处理一个外植体加入25微升L和P储备液，或加入25微升对照载体。

对于对照组外植体，轻轻敲击离心管以充分混匀。使用弯头显微解剖镊子将混匀的培养基转移至已标记的12孔组织培养板的每个孔中。将每个选定的支气管外植体转移至组织培养板的各个孔中。

24小时后，在37摄氏度的可控气氛模块化培养箱中继续孵育，并轻轻摇动。使用PBS将EXPLAN洗涤三次，随后进行固定、苏木精和伊红染色以及TUNEL检测。根据此处所示的文字方案，通过膜联蛋白V染色和流式分析对LMPs进行表征，并使用1微米珠进行设门，其中97%的MPS为膜联蛋白V Sci-Fi阳性。

通常，按照本方案可获得约 2.5 毫克的 LMPs。将 C57BL/6 小鼠的支气管组织外植体分别用载体和 LMPs 处理。本图中，支气管切片的组织病理学分析揭示了 LMPs 对支气管上皮结构完整性的影响。

对照组中，支气管上皮基本未受损伤。然而，在LMP处理的组织外植体中，表层上皮细胞层出现损伤或缺失，上皮细胞高度和密度均显著降低，如此处所示。

TUNEL阳性染色作为凋亡的标志物，在LMP处理的支气管上皮中比对照组织更为明显。在进行该操作时，需注意在制备微粒和进行组织外植体培养时，必须在无菌条件下操作。