通过多参数荧光激活细胞分选法分离人类淋巴管内皮细胞

本实验的总体目标是利用荧光激活细胞分选技术，分离出高纯度的人类淋巴管畸形及包皮组织中淋巴管内壁的淋巴管内皮细胞。首先通过酶消化法处理患者组织样本，随后将获得的单细胞悬液进行培养，以富集淋巴管内皮细胞的数量。

在样本中，细胞随后用针对特定细胞表面标志物的抗体进行标记，并通过多参数荧光激活细胞分选技术进行分选。最终，包皮及淋巴管畸形来源的淋巴内皮细胞可在细胞培养中扩增，以用于后续的深入分析。

该技术相较于现有方法的主要优势在于，荧光激活细胞分选所获得的细胞纯度超过99%，避免了因污染细胞过度生长而导致淋巴内皮细胞丢失的问题。首先称量一个含有10毫升培养基（添加抗生素-抗真菌溶液）的50毫升离心管，然后将淋巴管畸形组织或四块皮肤样本转移至该管中，再次称重以确定组织的重量。

接下来，在二级生物安全柜中，使用无菌镊子和无菌剪刀将组织和培养基转移至一个 100 毫米的组织培养皿中。最后，将组织切成 1 立方毫米大小的组织块，然后将其转移至含有 10 毫升新鲜抗生素-抗真菌剂培养基的 50 毫升离心管中。

轻轻涡旋混匀试管数次以重悬组织，然后离心样品。吸除上清液后，每100毫克剪碎的组织加入1毫升预热的消化液，在37°C培养箱中孵育组织，同时以200转/分钟持续振荡。为成功富集淋巴管内皮细胞，关键在于准确判断细胞暴露于胶原酶和dispase反应的时间是否充分，以确保细胞在分离过程中存活。

通过仔细监测组织消化过程，并在大部分组织已消化成细小碎片时及时终止反应，即可实现此步骤。孵育结束后，确认几乎所有组织均已分解为小碎片，然后将组织悬液通过70微米细胞筛过滤至无菌的50毫升离心管中。接着使用带有橡胶活塞的3毫升注射器芯杆研磨残留的组织，直至仅可见少量细胞外基质残留为止。

然后用与解离酶培养基体积相当的内皮细胞培养基冲洗细胞滤网，并将细胞悬液离心沉淀。根据样本大小，将沉淀物重悬于最多20毫升的内皮细胞培养基中。细胞计数后，将2×10⁶个细胞接种至经纤维连接蛋白预包被的150平方厘米培养瓶中，总体积为20毫升内皮细胞培养基，用于过夜培养。

次日早晨，用含抗生素-抗真菌溶液的 PBS 洗涤三次，以去除未结合的细胞。随后，为扩增淋巴内皮细胞数量，向细胞中加入新鲜的内皮细胞培养基，将培养物继续培养 5 至 7 天，直至培养物汇合度达到约 80%。为通过多参数荧光激活细胞分选技术对细胞进行分选前染色。

首先，移除细胞培养基，用 PBS 洗涤细胞三次。然后在 37 摄氏度孵育 5 至 7 分钟后，加入 7 毫升解离溶液。收集解离的细胞，用三倍体积的内皮细胞培养基终止酶反应，并将细胞悬液转移至无菌管中。

离心细胞三次，在最后一次洗涤后的第二和第三次离心中，每次用五毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤沉淀。将沉淀重悬于五毫升新鲜PBS中，并通过台盼蓝排斥法计数活细胞数量。完成细胞计数后。

无菌条件下将细胞转移至流式细胞术染色管中，离心沉淀细胞以阻断非特异性结合。用5%F-B-S-P-B-S重悬细胞，冰上孵育20分钟。阻断后离心，弃去上清液并重悬细胞。

将沉淀重悬于CD34、CD31抗体和VEGF受体3抗体混合液中。冰上孵育20分钟后，用2毫升FBS-PBS洗涤细胞三次，以去除未结合的抗体并重悬。将沉淀物重悬于300微升含碘化丙啶的FBS-PBS溶液中，置于冰上。

最后，使用多参数荧光激活细胞分选仪对纯化的人淋巴管内皮细胞进行分选。然后离心收集分选后的细胞，并将细胞沉淀重悬于适当的培养基中，用于细胞培养接种。此处显示的是用抗PODPL抗体标记的正常人淋巴管及人淋巴管畸形血管，注意观察人淋巴管畸形血管中明显的扩张以及管腔大小的显著差异。

事实上，大多数淋巴管畸形在未分级样本中经过初始组织消化并培养24小时后，均含有小囊性或微囊性和大囊性或巨囊性异常囊性结构。分选后并在细胞培养中再培养24小时，除成纤维细胞样细胞和平滑肌细胞外，还可观察到明显的内皮细胞克隆。然而，CD34、低表达CD31、VEGF受体3阳性及podoplanin阳性细胞会贴附于培养容器，并表现出如本图所示典型的鹅卵石样形态。

观看本视频后，您应能充分掌握如何利用荧光激活细胞分选技术，高效纯化分离出构成人类淋巴管畸形及完整皮肤淋巴管的淋巴内皮细胞。请注意，操作人体原代组织可能存在风险，因其可能含有对人体健康有害的感染性病原体。在进行本实验操作时，必须始终采取标准防护措施，例如佩戴手套、护目镜以及实验服。