骨诱导培养基：制备与生物活性检测

本视频的总体目标是介绍如何制备骨条件培养基，并在体外检测其生物活性。首先，使用骨刮匙从猪下颌骨获取骨碎片。第二步是在将骨碎片置于培养基中孵育24小时之前，对其进行热处理、脱矿处理或不做任何处理。

接下来，收集骨组织条件培养基，其中含有骨碎片释放的所有因子。最后一步是用骨组织条件培养基刺激细胞，或先将生物材料与骨组织条件培养基预孵育，然后在孵育结束后将细胞接种到材料上。最终通过定量实时PCR检测细胞经处理后基因表达的变化。

单独使用自体骨移植材料或将其与其他生物材料联合使用，可促进种植体周围骨缺损的骨再生，从而确保良好的长期效果。本视频展示了一种体外生物测定方法，可用于确定骨微环境中的生物分子对骨细胞的基因表达反应。骨微环境培养基有助于回答创伤、颌面及牙科领域中的关键问题，例如为何自体骨移植被视为骨再生中的金标准。

制备来自加工骨组织的条件培养基（如热处理骨自体移植材料或脱矿骨基质）可能难以标准化。因此，操作必须精确。首先，从当地屠夫处获取新鲜的猪下颌骨，并将其放置在坚固的表面上。

接下来，使用骨膜剥离器分离骨膜，形成全层骨膜瓣，同时需特别注意避免任何软组织残留在骨面上。骨膜去除后，牢固握住骨刮匙，以长距离刮取动作从下颌骨的颊侧采集骨碎片。丢弃长度小于1毫米的骨碎片。

将收集的骨碎片迅速用培养基覆盖于10厘米的培养皿中，以防止其干燥。当收集到足够量的骨碎片后，取5克骨碎片制备热处理对照组，通过以下方法进行巴氏消毒：在80摄氏度加热30分钟，或在121摄氏度下高压灭菌20分钟。

接下来，通过将五克骨碎片加入一摩尔盐酸溶液中，并在4摄氏度下置于摇床上震荡4至6小时，制备脱矿质对照样本。然后用培养基反复清洗骨碎片，直至达到中性pH值。将五克新鲜骨碎片以及每种对照处理各五克分别放入不同的培养皿中，向每个培养皿中加入10毫升新鲜培养基。

然后将样品置于37摄氏度的湿润环境中孵育24小时，以制备次日所需的条件培养基。吸出每皿中的培养基，并将其转移至15毫升锥形管中。将骨组织条件培养基在200 × g条件下离心10分钟，以去除所有碎片。

然后去除上清液，并通过0.2微米的无菌滤器过滤，将分装样品在-80摄氏度下冷冻保存，直至需要时使用。首先将人源间充质细胞（如成骨细胞或牙龈及牙周韧带成纤维细胞）以每平方厘米30,000个细胞的浓度接种于12孔板中。加入生长培养基覆盖细胞，并在37°C孵育过夜，使细胞在次日早晨贴壁。

弃去培养基，用预热至37摄氏度的PBS洗涤细胞。随后通过加入预热的无血清培养基刺激细胞，培养基中含或不含20%骨条件培养基。若同时需检测生物材料的吸附能力，则将含或不含骨条件培养基的培养基（包括相应的对照组）加入含有目标生物材料的试管中，并于37摄氏度孵育1小时。

然后用预热的PBS剧烈冲洗生物材料，并以每平方厘米30,000个细胞的浓度将人源间充质细胞接种到材料上。将单独培养的细胞或接种在生物材料上的细胞置于37摄氏度、湿润的环境中培养24小时。随后弃去培养基。

用预热的PBS洗涤细胞，并使用标准RNA提取方法提取细胞RNA。RNA提取完成后，取等浓度的RNA起始材料，对各处理组进行逆转录反应，制备cDNA样品。然后利用随附文本方案中列出的引物和条件，对样品进行实时定量PCR，以检测所选基因的表达水平。

最后，使用ΔΔCT法将基因的循环阈值归一化至看家基因Gabb dh，从而根据相对基因表达水平计算骨条件培养基的质量。以下是一些典型结果，显示口腔成纤维细胞在骨条件培养基中培养24小时后基因表达的变化。两个基因adrenalin和pent trax以及基因three的表达均显著下调至原始水平的40%，而白细胞介素11和33，以及N-A-D-P-H氧化酶four和蛋白聚糖four的表达则最多上调达200倍。

有趣的是，用于保护骨碎片免受周围软组织影响的胶原屏障膜会吸收大部分骨条件培养基，而该培养基正是引起基因表达变化的关键因素。然而，胶原膜未能吸收调控白细胞介素33表达的因子。因此，在此条件下，白细胞介素33的表达不受调控。

本方案可适用于研究涉及骨再生的不同类型细胞的反应。此外，该方案还可用于从加工骨及其他骨填充材料中制备条件培养基。这种生物测定的临床相关性尚不明确。

细胞在体内对BCM的反应可能更为复杂，涉及广泛的基因和多种不同的靶细胞，超出了本研究中所展示的范围。尽管如此，我们的生物测定实验首次揭示了骨来源RAF分子可能具有的复杂组成及其在体外的细胞反应。