利用小鼠胚胎胸腺定植前体细胞的表征 体内 和 体外 检测方法

本实验的总体目标是分析由 E13 或 E18 胸腺定植前体细胞产生的 T 细胞在生成动力学及数量上的表型特征。该目标首先通过分离 E13、E14 和 E18 小鼠胚胎的胸腺叶来实现。第二步，将 E14 胸腺叶进行辐照处理，随后在悬滴培养体系中接种经流式分选的 E13 或 E18 细胞，并共培养 48 小时。

在最后一步中，将定植的叶瓣移植到成年CD3基因敲除小鼠的肾包膜下。最终，可通过流式细胞术检测嵌合动物血液中E13和E18胸腺定植前体细胞的后代是否存在。该技术相较于现有方法（如在基质细胞上进行的体外T细胞培养）的主要优势在于，它结合了三维实验体系中从明确前体细胞实现完整T细胞成熟的方法，并将胸腺器官样培养物移植至完整受体小鼠体内，从而能够评估胸腺切片来源前体细胞及其后代的分化能力与功能。

作为一名具有啮齿类动物外科手术专长的研究工程师，我将演示以下操作步骤：在层流罩内，于移植实验前两天，用70%乙醇擦拭一只怀孕雌性小鼠的腹部，并沿腹中线做纵向皮肤切口，将皮肤向两侧拉开以暴露切口，然后使用镊子和剪刀切开腹膜，注意避免接触消化道。接着，取出双角子宫，并用剪刀将其与阴道分离。随后，将子宫置于一个90 × 15毫米的培养皿中，内含40至50毫升DPBS溶液，并在每个胚胎的蜕膜之间进行横向切割。

使用精细尖头剪刀和精细镊子，沿胎盘与卵黄囊之间的区域剪开子宫肌层，取出每个胚胎。随后去除羊膜，保留胚胎，并将胚胎置于一个新的含有HBSS加1% FCS的培养皿中。为分离胸腺，将胚胎逐一置于双目放大镜下，仰卧位放置。

然后沿胸骨软骨纵向插入一把镊子，使用弯头镊子夹住并撑开胸腔网格。将胸壁拉向一侧，以观察气管两侧的胸腺叶。接着用精细镊子夹住胸腺下方，小心地摘除每个胸腺叶，并将其置于含有1毫升HBSS加1% FCS的培养皿中。

接下来，使用两把精细镊子去除周围结缔组织，注意不要损伤小叶。然后用3 mL含1% FCS的HBSS洗涤小叶，以去除红细胞，开始进行胎鼠胸腺器官培养照射。所用E14胸腺小叶如前所示，来自CD45.2胚胎。

让叶状组织静置约三小时。然后离心收集 freshly sorted E 13 或 E 18 胸腺定植前体细胞。将沉淀重悬于培养基中，最终浓度为每 35 微升培养基含 500 个细胞。

然后，在60孔Terasaki板的每隔一个孔中加入35微升细胞悬液，并在每滴悬液表面放置一个经辐照的叶状结构。盖上板盖，将其倒置，使细胞在重力作用下沉降到液滴的顶端，轻轻敲击倒置板的上表面，促使叶状结构滑向液滴的顶端边缘。随后，将倒置的板置于加湿培养箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育48小时。

在胸腺叶被定植后，通过观察受体动物是否缺乏反射反应来确认其麻醉水平。然后在每只眼睛上涂抹一滴眼膏，并将小鼠置于层流罩下右侧卧位。接着剃除后肢关节上方的手术区域毛发。

接下来，戴上一副无菌手套，并用70%乙醇和10%碘达醇溶液对术区进行消毒。使用手术刀穿过皮肤组织做一道1.5厘米的切口，随后切开肌肉组织。现在轻轻按压切口两侧，使肾脏从腹腔中部分外露，并用生理盐水保持肾脏湿润。

用棉签将肾脏固定于腹膜后腔外，使用两把精细镊子在肾包膜上制造一个2至3毫米的孔。然后轻轻撑开包膜壁，将最多六个胸腺叶移植物滑入肾极边缘下方，并将肾脏放回腹膜后腔。先缝合肌肉和筋膜，再用单个外科结缝合皮肤。

然后用10%聚维酮碘溶液润湿伤口，将小鼠置于37°C加热垫上，监测动物状态及手术伤口，直至两者完全恢复，以确定耗竭内源性胸腺细胞、促进定植前体细胞发育的最佳方法。在本实验中，比较了经辐射处理或五天脱氧鸟苷处理后，定植胸腺叶中T细胞重建水平的差异。尽管在培养第9天时，两种处理组中定植淋巴细胞的数量无明显差别，但在第12天，辐射处理组的胸腺叶中T细胞数量多于脱氧鸟苷处理组，因此选择辐射处理作为促进胸腺定植后T细胞发育的优选方法。为研究E13和E18阶段胸腺定植前体细胞的发育潜能，本实验将等量的这两种前体细胞接种至E14辐射处理的胸腺叶中。结果表明，E13胸腺定植前体细胞产生的胸腺细胞和双阳性T细胞数量少于E18胸腺定植前体细胞。

然而，成熟 CD3 阳性细胞的频率增加，并且仅在 E13 胸腺定植前体细胞的子代中检测到树突状上皮 T 细胞的产生。为了分析 E13 和 E18 胸腺定植前体细胞的体内潜能，将分别由每种前体细胞定植的胸腺叶移植至 CD3 基因敲除受体的肾包膜下。正如刚刚所展示的，结果符合预期：E13 胸腺定植前体细胞产生 T 细胞的速度快于 E18 前体细胞，尽管总体而言，E13 胸腺定植前体细胞定植动物体内的循环 T 细胞数量显著较低。该技术发展之后，为发育免疫学领域的研究人员探索 T 细胞亚群的特性开辟了道路，其中部分 T 细胞亚群严格起源于胚胎期，且可在哺乳动物模型中进行研究。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在自然环境甚至竞争条件下，追踪Timex定植前体细胞及其子代细胞的分化与功能通路。