大鼠头部分支肌卫星细胞的分离与鉴定

本实验的总体目标是从来源于第一、第二和第四咽弓的代表性肌肉中分离出卫星细胞，并将其培养在细胞外基质凝胶点上。该过程首先解剖年轻成年大鼠的二腹肌、上睑提肌和腭帆提肌。

第二步，通过酶解及特定消化时间和条件，从每份肌肉样本中分离卫星细胞。随后将细胞培养在细胞外基质凝胶上。最终，可通过对目标肌肉标志物进行染色，追踪卫星细胞培养物中肌生成的动态过程。

唇裂和腭裂是人类最常见的颅面部畸形之一。当存在裂隙时，需要通过手术修复来闭合缺损，以实现正常的语言发育。然而，纤维化和肌肉再生缺陷可能会阻碍软腭肌肉的功能恢复。在腭裂修复术后，您可以展示一种创新方法，利用仅毫米大小的细胞外基质凝胶点状涂层，对 freshly isolated satellite cells 进行原代培养。

这可以避免需要进行扩增。在分离前一天，将八孔培养腔载玻片放入一个100毫米的培养皿中，并将培养皿转移至低温表面。10分钟后，使用预装的微量移液器向每个孔中加入一滴10微升的细胞外基质凝胶。

将载玻片再冷却七分钟后，彻底去除残留的凝胶，并于37摄氏度下干燥孔洞过夜，次日进行后续操作。为解剖咬肌，取一只九周龄大鼠，去除其头部皮肤，并使用皮下注射针头将头部侧向固定。在硅胶垫上分离出腮腺和面神经，然后摘除腮腺。

接着，使用15号手术刀片小心地分离面神经。辨认出咬肌的浅头部分。然后，用直止血钳将肌腱从其在颧突的起点处分离，再用解剖剪小心地切断该肌腱。

使用手术刀，解剖咬肌的浅层部分，直至其在下颌支外侧面的下缘及角部的止点。为解剖二腹肌的后腹，先用针将头固定于仰卧位，去除覆盖在舌下腺和下颌下腺上方的皮下脂肪。暴露二腹肌的前、后腹，然后用直镊夹住后腹的前腱，小心地将其切开并解剖至其在鼓室泡处的起点。

为了分离提上颚肌，需先定位茎突咽肌。将其向外侧牵拉，并小心去除周围的肌肉组织。接着，定位提上颚肌插入鼓泡的肌腱，并仔细进行分离。

然后从气管后方抬起食管。辨认腭帆提肌在软腭上的附着区域，并将该肌肉切断分离。随后将肌肉浸入70%乙醇中，再转移至含有抗生素的冰冻PBS溶液中。

为了分离卫星细胞，将每块肌肉转移至六孔板的各个孔中，并将组织切成约2毫米的小块，注意不要过度剪碎肌肉。接着，每孔加入2.5毫升0.1%蛋白酶溶液，在37摄氏度下轻轻振荡孵育60分钟，每隔20分钟轻柔摇动一次。

当纤维束A表现出松散外观时，向每孔加入2.5毫升添加了马血清和抗生素的DMEM培养基，然后将消化后的组织转移至各自的15毫升锥形管中。离心收集组织悬液，弃去上清液。随后向每根试管中加入5毫升培养基，并用10毫升塑料移液管匀浆组织。

再次离心组织，将上清液转移至新的15毫升锥形管中。然后向管中再加入5毫升培养基，再次吹打组织块，直至碎片能顺利通过移液管。再次离心后，将上清液收集到相应的对应管中，并通过40微米滤网将细胞悬液过滤至各自的50毫升管中。

用一毫升 DMEM 冲洗滤筛，以获得最大细胞回收率。然后离心收集细胞，将沉淀重悬于新鲜培养基中，并对细胞进行计数，以培养分离的卫星细胞。接着，将细胞悬液稀释至每 10 微升培养基含 1.5 × 10³ 个细胞。

然后将10 µL细胞加入到每个预先制备好的细胞外基质凝胶点上，在37 °C条件下孵育6小时。小心地向每个凝胶点加入400 µL培养基，并将载玻片放回培养箱中。3天后，在细胞分离后立即加入相应的培养基以启动细胞分化。

超过90%的新分离的卫星细胞表达Pax7。到第4天，所有肌群来源的卫星细胞均表达Pax7和MyoD。在所有肌群中，MyoG在第7天高表达。接种于细胞外基质凝胶后4天，增殖的细胞开始融合并形成小型的多核肌管，这些肌管在第7天和第10天表达肌球蛋白重链。

到第10天时，可明显观察到长而结构良好的肌管。同时也能观察到肌管的收缩现象。本方案可用于研究源自胸头肌的卫星细胞，并为唇腭裂患者的治疗提供新的可能性。