通过Zebrafish克隆细胞分析可视化胚胎下颌软骨细胞的嵌合与定向增殖

以下实验的总体目标是通过斑马鱼克隆细胞分析，观察软骨细胞之间的相互关联与延伸。为此，需构建 SOX10ERT2-Cre 斑马鱼 M 系，以实现颅面软骨组织及胚胎中组织特异性的重组，用于克隆分析。随后，在胚胎发育至10体节期时，以他莫昔芬处理3小时，以诱导重组过程的发生。

然后根据 CRE 活性的表达以及强红色荧光或 RFP 表达来筛选胚胎，并将胚胎固定以进行 C 型颅面软骨的成像。结果显示了基于共聚焦成像的颅面软骨细胞的多光谱细胞分析。该技术相较于现有方法（如 S 蓝染色或 so 和 GFP 或 SOX 与 kde 的转基因品系）的主要优势在于，斑马鱼弓形系统使我们能够特异性地观察和追踪参与器官形成的克隆细胞群体。

为准备第1天的胚胎收集，在确认胚胎在荧光显微镜（RFP滤光片）下已达到10细胞期后，于次日17:00至18:00之间，将多对sox10:ERT2:Cre zebrafish转基因斑马鱼雌雄配对放入分隔的交配缸中。分离出亮红色的胚胎，并将其转移至新的培养皿中，加入新鲜的E3培养基以诱导Cre重组。向培养皿中加入10 µM他莫昔芬溶液，于28.5 °C孵育胚胎3小时。

然后将他莫昔芬溶液倒入生物废弃物容器中，并用E3培养液在28至29小时（螨虫阶段）过夜孵育胚胎后反复冲洗数次，将胚胎转移至含PTU的E3溶液中，并放回培养箱继续孵育。为观察完全发育的颅面结构，选择在4天后（4 DPF）视网膜中具有强烈红色信号和黄色Cree表达的胚胎。根据文本所述方案，用Trica麻醉胚胎后，将其转移至含有甲基纤维素液滴的洁净共聚焦载玻片上的培养皿中。

滴加一滴新鲜的甲基纤维素，使用移液器吸头将胚胎背侧朝上固定，注意避免用25 mm × 25 mm的盖玻片直接接触胚胎。盖上盖玻片后，如需调整，可通过盖玻片轻轻操作胚胎。成像时，使用20倍干镜物镜观察胚胎。

为了对焦样本，按下显微镜上的 L 100 按钮，然后选择共聚焦设置按钮。点击自动，并为通道一选择 CFP，通道二选择 GFP，通道三选择 RFP 或 mCherry。然后关闭窗口。

在单击解除联锁按钮之前，先打开第二和第三通道。然后单击播放以开始扫描。调整设置后，捕获所需图像，并以共聚焦软件格式以及按通道的TIF格式保存，以便进行图像处理。

进行CFP成像时，关闭第二和第三通道，打开第一通道，且不改变焦平面。在采集图像前重新调整扫描参数，按前述方法保存图像，并按照Pan及其同事所述的方法进行图像处理，如图所示。通过整体茜素蓝染色进行传统软骨可视化，在观察发育中的Meckel软骨方面具有重要价值，常用于观察最终的细胞排列结构，以便进一步分析软骨细胞随时间的谱系追踪。

利用SOX10 10 kDa转基因品系，可通过斑马鱼M转基因品系的活体成像技术，研究活胚胎中的细胞迁移以及汇聚延伸过程。为进一步研究颅面骨骼结构中软骨细胞的排列方式，揭示了介导梅克尔软骨延伸与生长的软骨细胞间整合与伸长过程。该图显示了3 dpf至受精后5天期间UI斑马鱼M Sox10 ERT2 CreERT2转基因胚胎的下颌结构。

下颌最好从腹面进行成像，以清晰显示此处梅克尔软骨中细胞的排列情况。稳定维持并可遗传的颜色标记便于进行谱系追踪和颅神经嵴细胞命运图谱的绘制。单个蓝色细胞似乎迁移并与邻近细胞整合，随后沿前后轴伸长，形成形态均一的软骨区域，从而在向前延伸过程中维持梅克尔软骨的整体形状。

该技术为猫发育领域的研究人员探索软骨在斑马鱼骨骼形成中的作用提供了途径。