利用海洋沉积物培养产硫化物污泥及其在上流式厌氧污泥床反应器中还原三氯乙烯 海洋沉积物，产硫化物污泥，三氯乙烯，上流式厌氧污泥床反应器，生物还原，含氯有机物，硫酸盐还原菌

以下实验的总体目标是从海洋沉积物中在A-U-A-S-B反应器内培养出产硫化物的污泥，并评估其对三氯乙烯（TRICHLOROETHYLENE或TCE）的还原性能。该目标通过采集海洋沉积物实现，以获得大量微生物种群，这些微生物在含有适当矿物质、培养基维生素和挥发性脂肪酸作为电子供体的环境中，可富集硫酸盐还原菌。第二步是将海洋沉积物作为接种物用于A-U-A-S-B反应器中，在硫酸盐还原条件下运行并维持数周，直至达到稳定的硫酸盐还原活性。

接下来，通过评估硫化物生成型UASB反应器中的微生物群落对三氯乙烯（TCE）的还原能力，以考察污泥在硫化物生成仍处于活跃状态时转化有机污染物的能力。结果表明，生物反应器中已成功建立硫化物生成过程，且基于微生物群落分析，污泥在硫酸盐还原条件下能够还原TCE，提示TCE的还原是由硫酸盐还原菌与发酵细菌共同组成的微生物群落完成的。该方法相较于现有方法（如将产甲烷菌群适应于Tosis）的主要优势在于，所获得的菌群对较高浓度的硫酸盐具有耐受性，并且不会与产甲烷菌在底物利用上产生竞争。

通常，初次接触该方法的人员会遇到困难，因为他们期望槽道能够立即形成。他们可能会过于频繁或不够频繁地向生物反应器中添加营养物质和硫化物。这些做法只会导致系统失衡。

定期分析化学需氧量（COD）、硫酸盐和硫酸根含量，有助于了解反应进程，并确定下一步操作的合适时机。我们最初提出该方法，是希望获得一种具有高活性的硫酸盐光合菌体系，以实现有机物和污染物的协同去除，而这一目标在异养条件下难以达成，特别是当部分污染物与重金属共存时。我们采用了一种通用方法，并借助良好的设备对菌群中的细菌进行了鉴定。

以16S rRNA基因区域为分析靶标，我们发现了有趣的细菌类群。开始此实验步骤前，按照文本方案中所述收集海洋样品。进入实验室后，取大量沉积物样品，使用适当的筛网从沉积物中去除大块的碳质碎屑。

将沉积物通过筛网后，混合选定的部分以确保其均匀。本实验采用总工作体积为三升的上流式厌氧污泥床玻璃反应器。确保沉积物基础培养基缓冲液和挥发性脂肪酸的最终体积等于反应器的最终工作体积。

根据反应器的工作体积，配制含有磷酸盐、氯化物、氮源、镁盐、微量元素和维生素的碳酸氢盐缓冲基础培养基储备液。接着，配制由乙酸、丙酸和丁酸组成的挥发性脂肪酸储备液。这三种挥发性脂肪酸应按照2.5:1:1的化学需氧量（COD）比例加入，使反应器中的最终COD浓度达到2.7克/升。

最后，配制适当浓度的硫酸钠储备液，使反应器中硫酸根离子的最终浓度达到 4,000 毫克/升。溶液配制完成后，将沉积物放入反应器中，并与部分基础培养基混合，以确保其沉入反应器底部。将剩余的基础培养基和缓冲液与挥发性脂肪酸溶液及硫酸盐溶液混合。

确保将挥发性脂肪酸溶液倒入液体中，然后将合并后的溶液加入反应器。将反应器的连接管路与循环泵相连接。

然后将循环流速设定为60毫升每分钟。将生物反应器置于温度控制室中，并定期保持34摄氏度。检查温度波动是否较小。

最后，连接气体置换柱。经过一周的培养后，取5至7毫升液体样品，用于分析COD、硫酸盐和硫化物含量以及pH值。按照标准方法，采用亚甲蓝法测定液体中的硫化物。

首先，将五毫升醋酸锌溶液加入25毫升容量瓶中。然后迅速向醋酸锌溶液中加入200微升样品。接着加入2.5毫升DMP溶液和125微升硫酸高铁铵溶液。

用蒸馏水定容至25毫升容量瓶刻度线。等待30分钟使反应完成，直至蓝色稳定。反应完成后，需再等待至少15分钟，但不得超过60分钟。

在分光光度计中检测样品时，于670纳米波长下测定最终蓝色溶液的吸光度。采用浊度法将硫酸盐定量为硫酸钡。首先，在25毫升容量瓶中加入5毫升缓冲溶液。

然后加入1 mL previously在11,320 ×g条件下离心过的样品。用蒸馏水定容至25 mL刻度试管，并加入1 g氯化钡。在旋涡混合器中混匀溶液1分钟。静置4分钟，使硫酸钡沉淀形成，随后在分光光度计中于420 nm波长处读取样品吸光度。

为进行化学需氧量（COD）测定，需先将样品充分离心，以去除可能干扰COD测定的残留硫化物。离心后，取2毫升样品加入COD测定试剂盒的反应小瓶中。密封小瓶，并通过轻轻振荡使混合物均匀。

取另一反应小瓶，加入2毫升蒸馏水作为空白对照，并将混合物均质化。将小瓶置于150摄氏度的消解反应器中加热2小时。随后取出小瓶，在避光条件下冷却至室温。

在分光光度计中以 620 纳米波长读取小瓶的吸光度值。接着，从气体置换柱中获取气体体积。当硫酸盐被消耗完后，为每一批次补充新鲜的培养基和新的营养物质。

当硫酸盐消耗在24小时内超过80%，且此情况持续超过一周时，如前所述，将反应器的运行模式切换至连续模式。通过调节泵的流速，将水力停留时间（HRT）设定为24小时，并在任何一天均维持硫酸盐浓度为4克/升，COD为10克/升。在一个HRT周期结束后停止反应器，并如前所述，为每一批次提供新鲜的培养基和新的营养物质，COD浓度使用10克/升。

进料后，取5至7毫升液体样品，每小时检测一次化学需氧量（COD）、硫酸盐、硫化物和pH值。同时，记录TCE测试过程中产生的气体体积。配制TCE储备液时需注意，该化合物在生物反应器液相中的最终浓度必须为300微摩尔（µM）。

利用三氯乙烯（TCE）在34摄氏度下的亨利定律无量纲常数，考虑该化合物在顶空中的分配。随后，参照文本方案中所述方法，在气相色谱仪上针对待分析的每种化合物制备标准曲线。在一个水力停留时间（HRT）周期结束后停止反应器运行，并像之前一样，为每批样品补充新鲜培养基和新的营养物质，化学需氧量（COD）浓度为10克/升。

向生物反应器进料后，直接从储备液中将TCE加入生物反应器的液体中。生物反应器液相中的TCE最终浓度必须为300 µmol。在一个HRT周期结束时，将HRT设定为12小时。

取液体样品，检测化学需氧量（COD）、硫酸盐和硫化物。同时取顶空气体样品，用气相色谱仪进行分析。此处展示了生物反应器中硫酸盐还原的典型行为。

需要注意的是，在运行的最初几周内，硫酸盐还原速率较慢。不同的阶段表明，硫酸盐还原速率随时间逐渐增加，直至在不到24小时内消耗了4,000毫克/升的硫酸盐。此后，反应器进入连续运行状态。

污泥的发育情况通过反应器中硫酸盐还原的代表性结果展示。此处显示了随时间变化的硫化物浓度、COD 消耗以及 pH 值的变化。这些结果来自生物反应器连续运行数周后的实验数据。

在测试污泥还原三氯乙烯（TCE）能力的实验中，获得的结果如下所示。所测得的硫酸盐还原活性略低于添加TCE之前的水平。气相色谱分析表明，约80%的TCE被还原为乙烯。在采用本方案培养的污泥中，鉴定出硫酸盐还原菌、发酵菌和脱卤菌。

某些细菌属，如脱硫弧菌属（sulfa vibrio de sulfa）、脱硫杆菌（microbial des sulfide bacterium）、德哈克氏梭菌（clostridium deha backer）以及 SUL fossum，已被证实与硫酸盐还原及含氯化合物的生物降解相关。一旦掌握该技术，只要操作得当，便可采用不同的海洋沉积物以类似方式开展实验。该反应体系的形成时间可能因沉积物来源不同而有所差异。在进行该操作过程中，请务必定期检测化学需氧量（COD）、硫酸盐的质量平衡。

获得的菌群活性越高，其用于三氯乙烯（TCE）还原、乃至最终在硫酸盐还原条件下降解其他任何可降解有毒化合物的可能性就越大。观看本视频后，您应能够充分理解如何从海洋沉积物中在USB反应器内培养Genics菌群，以及如何评估其在TC还原中的性能。您应掌握如何对反应器进行接种，如何随时间跟踪还原反应进程，以及如何按照本方案开展TCE还原能力测试。

还可以进行其他基因分析的周期性测序等方法，以回答其他问题，例如总体上我们有多少细菌，或该菌群如何在绝缘光合环境中降解三氯乙烯（TCE）。