使用重建人角膜样上皮（RhCE）组织模型进行化学品眼刺激性危害识别的刺激性眼试验（EIT）

眼刺激试验的总体目标是根据物质和混合物的眼刺激潜力对其进行分类和标签。该实验采用一种三维重建的角膜类似组织模型。试剂盒到达后，需在检测培养基中预先孵育过夜；次日，对组织进行水化处理，然后将阳性对照、阴性对照以及待测化学品分别重复施加于组织表面。

经过固定时间的暴露后，通过清洗去除受试化学品。将组织在新鲜的培养基中进行后续孵育，然后通过 MTT 法评估化学品的毒性。最终，通过比较受试物处理组组织与阴性对照组处理组织的相对存活率，来评估受试物的刺激潜力。

该技术相较于现有方法（如快速痕量刺激试验）的主要优势在于，无需使用实验动物。它采用体外构建的类角膜眼部组织模型，该模型由正常人源细胞组成。该方法适用于各类物质和混合物，并能够区分引起眼部刺激或严重眼损伤的化学品与材料。

无需分类和标签的非刺激性物质。在带有多孔膜的插入物中培养出类似人角膜上皮组织或眼部上皮的重建组织，营养物质通过该多孔膜传递给细胞。

重建的组织形成一种非角化的上皮，其模拟角膜上皮，具有逐渐分层但未角化的细胞。收到人角膜样上皮试剂盒后，先将24孔运输容器中的组织平衡至室温。15分钟后，在无菌条件下打开装有24孔组织板的袋子，检查所有组织的琼脂糖凝胶与插入物之间是否存在气泡。剪开。打开胶带。

用无菌纱布移除盖子，检查组织表面。接着将一毫升 37 摄氏度的试剂盒检测培养基分装至预先标记的六孔板的各孔中。然后用无菌镊子将含有组织的插入物在无菌纱布上轻轻吸干，以去除残留的运输液，再将其放入六孔板的各个独立孔中。

一小时后，将培养基更换为1毫升新鲜的37摄氏度测定培养基，并在标准培养条件下过夜孵育组织。次日，向每份组织的顶面滴加20微升不含钙和镁的DPBS。如果DPBS未扩散至整个组织表面，可轻轻用镊子夹住插入物并轻敲培养板，以确保盐溶液润湿整个组织表面。

将培养板孵育30分钟。然后，根据时间表，以每组两个复孔的方式，向组织施加50微升阴性对照、阳性对照以及相应的液体受试物，以进行处理。注意确保处理液覆盖整个组织表面。随后，将插入物孵育30分钟，以用固体受试物处理组织。

首先，将插入物转移至无菌表面。保持培养皿加盖，以防止空气中的固体颗粒造成污染。然后使用已调平的药匙，根据时间表将50毫克的受试物均匀涂布于重复的组织上，注意确保处理物覆盖整个组织表面。

或者，使用一支预先装好且针头已被切除的一毫升注射器，将粉末直接施加到培养物上。在施加固态受试物后，立即推动活塞以施加粉末，随后将插入物放回六孔板中，并将组织在培养箱中孵育六小时，以冲洗组织。

处理结束后，在暴露孵育结束时，每个受试样品使用 3 个 150 毫升烧杯，分别加入 100 毫升 DPBS。用弯头镊子夹住小室的上缘，将其从孔中取出。然后用镊子夹住同一处理组的两个小室的上缘，将处理液倾倒至干净的吸水材料上。

接着，将插入物浸入第一个盛有DPBS的烧杯中，以环形旋转动作洗涤组织2秒。然后提起插入物，使其大部分充满DPBS，再将液体倒回烧杯中。在第一个烧杯中重复此洗涤步骤两次。

最后一次洗涤后，以同样方法在第二和第三个烧杯中用 DPBS 各冲洗插入物 3 次。将每个插入物旋转至大约 45 度角，开口端朝下，轻轻将上缘接触吸水材料，以去除残留的 DPBS。随后立即将组织浸入 5 毫升室温培养基中。

在预标记的12孔板中，于浸泡后孵育阶段结束时，倾去培养基，并将插入物置于吸水材料上轻轻吸干。随后将插入物转移至新的6孔板中，每孔加入1毫升预热的培养基，将板放入培养箱中以开始MTT活力检测。接着将插入物转移至24孔板中，每孔含0.3毫升新鲜配制的MTT溶液。

在转移前将插入物轻轻按压在吸水材料上。释放插入物下方困住的任何气泡，并在三小时后将组织放回培养箱，同时将插入物底部再次按压在吸水材料上。随后进行非着色液体测试样品的浸没提取时，将插入物浸入预先标记的24孔板中，每孔加入两毫升适当的提取液；对于非浸没提取的固体或液体着色剂，则另作处理。

将插入物转移至预标记的六孔板中，每孔加入一毫升提取液。然后使用热封仪或封口膜密封六孔板，以防止蒸发，并在室温下于旋转摇床中轻柔振荡提取2至3小时，完成浸没提取。刺穿组织后，将每个插入物中的液体倾倒回原孔中，随后丢弃带有组织的插入物。

混匀每个孔中的提取液，并按照非淹没提取末尾示意图所示，将每份样品的两份200 µL等分试样转移至已预先标记的96孔板中相应的孔内。丢弃未穿孔的插入物和组织，向每个孔中加入1 mL提取液。充分混匀各孔中的提取液，然后如上所述，从每份样品中各取两份200 µL等分试样，转移至另一块预先标记的96孔板中相应的孔内。

最后，在96孔分光光度计中于570纳米波长处测定样品的光密度，不使用参考滤光片，并将结果输入电子表格以计算相应的组织活性。根据本实验方案文本中所述，需对测试化学品干扰进行校正。本实验展示了使用10种测试物品以及阴性对照和阳性对照进行的代表性眼刺激测试结果。阴性对照的平均光密度为1.31，对应100%的组织活性；阳性对照的相对组织活性为31.2%。测试物品1、2、4、7和8的组织活性均高于60%，被归类为非刺激物；测试物品3、5、6、9和10则未达到该阈值。

另一方面，所测试样品中除测试样品二外，其余样品的组织变异性均小于或等于60%，因此被归类为刺激物。本实验中，除测试样品二外，所有测试样品的重复组织间活性差异均小于20%。因此，除测试样品二外，其余所有测试样品的结果均被视为合格，因其符合所有眼刺激试验的接受标准。

观看本视频后，您应充分了解如何利用体外重建的人角膜类似组织模型4进行DICATION测试，以实现化学品的危害识别与分类。该方法已被纳入EOC D测试指南，作为分级测试策略的一部分。