单分子荧光显微镜在平面支撑双层膜上的应用

在本视频中，我们将展示如何制备和表征生物功能化的平面支撑双层脂膜。我们还将详细描述具备单分子检测能力的全内反射显微镜的结构。我们将测量激发光功率密度、流动性以及脂双层中的蛋白质密度。

首先简要介绍平面玻璃支撑的脂质双层。当小型单层囊泡接触洁净的玻璃表面时，会破裂并铺展形成连续的脂质双分子层。在水合缓冲层中，我们通常选择棕榈酰材料。

1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰胆碱（POPC）是最主要的脂质，因为它能够在室温及37摄氏度下形成流动的脂双层。为了实现功能化，我们添加了镍偶联脂质（nickel antiox），这是一种带有镍螯合头基的合成脂质，可结合多组氨酸标签蛋白。例如，共刺激分子B7-1、黏附分子ICAM-1，以及用于T细胞识别的荧光标记肽段负载的MHC分子（如图所示）。然而，该脂双层系统原则上也可用于研究多种生物系统中完全不同的生物学过程。

由于平面系统的特性，可以在全内反射模式下监测荧光事件，这种模式可显著降低细胞背景信号，非常适合单分子荧光显微镜观察。进行脂质制备时，需要以下材料：脂质POPC、镍抗氧氯仿以及一个洁净的圆底烧瓶。将脂质按所需比例溶解于氯仿中，并在真空条件下干燥，如图所示。经过一夜的高真空处理后，脂质会在烧瓶内壁形成一层薄膜。进行脂质再水化时，使用脱气的PBS缓冲液，取10毫升加入干燥的脂质混合物中。

请勿混合。现在为避免脂质氧化，向烧瓶中通入惰性气体（如氮气或氩气），并旋转烧瓶。脂质将形成乳白色悬浮液。

取少量样品作为空白对照，用于分光光度计，以防止下一步过程中发生气体交换。必须严格密封含有脂质悬浮液的烧瓶，这一点至关重要。使用耐热的粘性胶带（例如高压灭菌胶带），在使用密闭超声波水浴进行物理制备时提供空气保护。

安装烧瓶后，以最高170瓦的功率开始超声处理，超声60分钟。由于物理作用，浊度已显著下降。

可通过 550 纳米处的分光光度法验证。以超声处理前取样的等分试样作为空白对照。230 纳米处的光密度值（反映脂质含量）应保持恒定。

在此，我们将一毫升脂质悬浮液加入小型超速离心管中，并将其置于台式超速离心机的固定角转子内。用于双层膜制备时，必须仅使用小型单层囊泡。在超声处理过程中也会形成较大且更致密的多层囊泡，这些囊泡会影响双层膜的流动性，因此必须通过离心将其沉淀并去除。

首先，在室温下以 150,000 G 离心一小时。将所得上清液在 4 摄氏度下以 288,000 G 再次离心八小时。玻璃片在脂质囊泡能够在其表面铺展形成连续且具有流动性的双层膜之前，必须非常洁净。

为此，我们将盖玻片放入聚四氟乙烯（Teflon）容器中，然后将其置于玻璃器皿内进行操作。操作时需格外小心，佩戴护目镜、防护手套并穿上实验服，在通风橱中进行。加入一份30%过氧化氢和三份浓硫酸，以生成具有高反应活性和强氧化性的过一硫酸。

该混合物与有机物（包括皮肤、眼睛和衣物中的有机物）会发生剧烈反应，并立即产生热量。将载玻片孵育30分钟。

用镊子夹取盖玻片，使用蒸馏水或高质量的去离子水彻底冲洗干净的盖玻片两面，去除酸液。然后将盖玻片放置在聚四氟乙烯支架上，干燥时间不超过10分钟，以便能够同时制备多个独立的脂双层。我们将干燥的盖玻片用快速固化胶水粘合固定。

将双组分环氧胶按1:1比例混合，用于八孔或十六孔实验板腔室。首先，小心地从框架中取出原始的 lept 玻璃盖片。

将胶均匀地涂抹在腔室框架底部的凹槽中。将干净的盖玻片放置在腔室框架底部涂有胶的区域。确保玻璃载片与塑料框架之间的胶分布均匀。

让胶水固化30分钟。将脂质物理悬浮液用PBS按1:10稀释，并通过0.2微米滤膜过滤，每孔八孔板加入120微升该稀释液，或每孔十六孔板加入60微升。确保整个玻璃表面被覆盖，静置20分钟。

双层膜现已形成。为去除残留试剂，用30毫升PBS冲洗每个孔。务必避免玻璃表面暴露于空气中，否则会立即破坏双层膜。确保每个孔中含有相同体积的缓冲液。在接下来的蛋白质修饰步骤中，将每个孔完全加满，并移除液面弯月面。

取出 330 微升，每孔中将剩余约 350 微升。为了在双层膜上结合蛋白质，配制含有目标多聚组氨酸标签蛋白的混合液，并向每孔中加入 50 微升。

蛋白质会结合到暗色脂质的镍抗头基团上，为确保结果可重复，需充分但轻柔地混合，并始终孵育60分钟以去除未结合的蛋白质。用30毫升PBS再次洗涤。现在让我们聚焦于显微镜硬件。

首先，我们将阐述基于物镜的草坪显微镜（turf microscopy）对全内反射显微镜的技术要求。需要使用高数值孔径的油浸物镜。入射的激光激发光束经二向色镜反射后，仅通过两到三个透镜组成的透镜组，聚焦于物镜的后焦平面。

然后，激光束沿光轴以准直光束的形式引导至物镜。通过这种方式，荧光样品在其整个深度上被均匀照射。当您将光束沿垂直于光轴的方向移动时，光束仍保持准直状态，但以倾斜方式离开物镜。

如果继续平移，最终会达到一个临界角度，此时光束在玻璃盖玻片与样品之间的界面上发生全反射。所产生的隐逝波强度呈指数衰减，仅能激发位于界面附近、距离不超过数百纳米范围内的荧光分子。接下来，我们演示如何手动将激光束聚焦至物镜的后焦平面。

使用三个或两个透镜组中的前两个透镜，可扩大激光束的直径。它们的焦距之比决定了在样品平面上照明光斑的大小。为确保光束保持准直，应调节这两个透镜之间的距离，使其等于两者焦距之和。

第三个透镜用于将扩束后的光束聚焦到物镜的后焦平面。由于该透镜的焦距需要适配显微镜主体及关联潜望镜的尺寸，因此在本例中必须更长，约为75厘米，可有所变化。第二个透镜与第三个透镜之间的距离对光束特性没有影响。

因此，可以利用中间的无限远空间以定义的方式对光束进行调控，而不会产生畸变。例如，可以插入一个孔径光阑，并将其精确地投影到样品平面上。本质上，使用两个透镜而非三个透镜也能实现相同的效果。

双透镜系统的定义较不明确，但引入的透镜像差较少。对于时间调制，诸如光阑之类的简单结构仍然可以很好地实现。可将气体、铁或固态激光器置于毫秒量级的快门（例如机械快门或全光学调制器）前方。

一个很好的替代方案是使用二极管激光器，它可以通过电子方式调制，且无需外部快门。仅需两面镜子即可将光束引导至任意位置并沿任意方向传播。如前所述，两个透镜用于展宽光束，并将其聚焦到显微镜物镜的后焦平面。

我们可以通过在光学导轨上移动潜望镜的下部反射镜来实现光束在草坪配置中的移位。对于图像检测，我们使用高灵敏度相机。例如，可以使用电子倍增电荷耦合器件（emCCD），或者将另一束不同波长的激光对准光路。

通过使用反射镜和二向色镜叠加装置。为了实现同时进行双色检测，我们将一个市售的光束分离装置置于发射光路中。在实验中，拥有两条独立的激发光路非常有用。

例如，一个用于全景成像，另一个用于靶向光漂白或激活。通过使用一组两个50/50分光镜即可轻松实现该功能。如本图所示，两套不同的透镜和反射镜调节系统将产生两个独立的光束轮廓和光束角度。

例如，用于草坪区域成像的光束口径较宽，而用于非草坪区域的漂白或激活的光束口径则更聚焦。可在非草坪光束路径中放置一个光阑，以精确控制漂白或激活光斑的形状。另外配备两个快门，分别对应两条光束路径，可独立控制激光开关，同时保持物镜处于笔直、无倾斜的光路中。

打开功率计，并将其调整至对应的激光波长。在物镜处测量激光光的功率，并记录下来。现在，移动显微镜后方的反射镜，将物镜处的激光束倾斜至草坪位置。

切勿直接注视激光。在右下角，您可以看到通过带有荧光蛋白的双层膜发出的荧光所呈现的激发激光强度分布图。此处我们采用伪彩色表示法，以突出显示不同强度的区域。

在足够大的感兴趣区域内测量背景的平均强度。该值取决于特定的相机设置，例如 EM 增益和读出速度，需从所有测量的强度值中减去。测定整个照明区域内的平均强度。

选择足够大的直径，使得边缘处的强度值与相机背景的强度值相近，测量中心区域的平均强度。该区域即为后续显微实验所要观察的兴趣区域。然后，从被去除区域和中心区域的强度值中减去平均背景强度值。

接下来，将背景校正后的强度乘以相应区域大小的像素数量，得到积分强度。将照射区域的积分强度设为1，并计算中心区域的分数。使用功率计测量得到的功率。

在本例中，5毫瓦与整个照明区域的积分强度成正比。将该值乘以中心区域的功率比例，即可确定中心区域内的功率。在我们的示例中，为1.15毫瓦，将像素数量转换为平方微米的转换因子取决于相机芯片的实际像素尺寸以及发射光路的放大倍数。

使用微米尺可轻松测定。在本示例中，中心区域面积为170.8平方微米。功率密度是指测得的功率除以面积，因此等于1.15毫瓦除以170.8平方微米，即0.007毫瓦每平方微米。

即 0.7 千瓦每平方厘米。为了测定脂双层的流动性，我们进行包裹实验的荧光漂白后恢复检测。如左下角视频所示，我们在低功率密度下对荧光标记的脂双层进行成像。

在右下方的视频中，您可以看到显微镜上对应的实验室技术腔室。随后，我们使用短时高功率密度脉冲对一个圆形区域进行漂白，并在低功率密度下监测其恢复情况。同样，该图像序列提供了实验在不同时间点的概览，其中零时刻对应漂白脉冲。

我们在标记的圆圈内定量测定经背景校正后的平均荧光强度，并将所有测得的强度归一化至实验开始时的强度值。在进行漂白脉冲之前，将归一化的强度值对时间作图。饱和值代表本实验中的可移动组分，通常超过90%。首先，在低激发功率密度下获取双层膜的图像。

例如，通过使用光学密度滤光片，其对数衰减值为2，可使光功率降低100倍。在整个实验过程中，曝光时间应保持恒定，并足以在未衰减的功率密度下成像单个流体作用力；在本例中，曝光时间为10毫秒，功率密度为0.7千瓦每平方厘米。使用伪彩色表示法以突出显示不同强度的区域。

选择一个将用于后续单分子测量的兴趣区域，以及另一个相同大小的区域。为进行背景扣除，计算扣除背景后的积分强度。现在从激发光路中移除光密度滤光片，对选定区域进行漂白并采集图像。

您将观察到单个荧光分子在漂白区域中扩散。单个荧光分子的衍射受限，典型直径为两到三个像素，围绕每个单分子信号选取一个七乘七像素的区域，以及附近的一个相邻区域。为进行背景扣除，重要的是仅对单个荧光分子的信号进行定量。

因此，最好以蛋白质与BI层的比例小于1的条件对蛋白质进行成像，或仅对特异性标记的SAT蛋白质进行成像。即使蛋白质比例达到1（如本示例所示），也应测量两个区域的积分强度，并从信号中减去背景，以避免将示例中最后观察到的事件误判为漂白（因为在曝光过程中可能已发生漂白）。在此对校正后的信号进行处理，我们对在九帧图像中观察到的四个荧光之一执行此操作。

然而，该操作应至少对数百个单分子事件进行。让我们回到在衰减的激发光功率密度下观察到的原始双层图像。通过将感兴趣区域的积分强度乘以一百，再除以平均单分子强度和面积，即可校正低激发光功率密度，从而确定分子密度。

我们处理的密度为每平方微米 421.4 个 Fluor 力单位。在本示例中，当饮食与蛋白质比例为 1 时，这相当于每平方微米含有相同数量的分子。观看本视频后，您应能够利用单分子荧光显微镜制备并表征功能化蛋白质的脂双层。

此外，您应熟悉为实现此目的而对标准显微镜进行改造和升级的基本原理。我们将在后续实验中采用该方法来测定双层膜结合抗原与细胞表面T细胞受体结合的动力学，但基于此方法的许多其他应用也完全可行。