研究微生物群落 体内宿主介导的相互作用模型 白色念珠菌 和 铜绿假单胞菌 在气道中

本实验的总体目标是建立一种模型，用于研究单个细菌与单个真菌之间的相互作用。该方法有助于回答病原体相互作用领域中的关键问题，例如哪些因素参与了跨界交流和种间“对话”。该技术的主要优势在于，由此体内模型产生的数据具有临床相关性。

为了通过鼻腔接种真菌，首先将每毫升含2×10⁶ CFU的白色念珠菌（C.albicans）用无菌PBS稀释。接着，在确认成年低张力小鼠失去翻正反射后，用200微升移液枪吸取至少50微升真菌悬液。然后，用一只手抓住小鼠，将其翻转，使其仰卧，腹部朝上。

当小鼠处于合适位置时，用握持小鼠的手的食指托住其头部，拇指保持下颌闭合，将移液器枪头移至靠近动物鼻部的位置。然后，小心地将50 µL真菌液滴加至小鼠鼻孔处，使液滴随小鼠的自主呼吸吸入。之后将小鼠单独放置于笼中，直至其完全恢复。

在接种白色念珠菌4天后，剃除安乐死动物的腹部毛发，随后用乙醇对暴露的皮肤进行消毒。接着，用剪刀从胸骨处沿腹部中线切开皮肤。然后，沿中线两侧的肋骨区域延长切口，并将胸侧的皮肤向两侧翻开。

当肋骨可见时，在胸部两侧向锁骨方向做垂直切口，利用胸骨将整个前胸壁向后翻开，以暴露心脏和肺。然后，使用预先用肝素处理过的注射器，在室间动脉附近穿刺心脏，抽取至少500微升血液。将血液样本置于冰上。

然后，沿颈部正中做一切口以暴露气管。仔细分离气管周围的筋膜，随后在气管下方穿过一根缝线。接着，使用20号改良灌胃针插入气管进行插管，并用预先放置的缝线固定套管。

进行支气管肺泡灌洗时，将500 µL冰冻PBS轻柔地注入肺部。随后吸取灌洗液，并将液体转移至预冷的2 mL离心管中。在收集另外两份500 µL的样本后，取出肺组织，并将其中一部分肺组织放入1.5 mL离心管中，立即在-80°C条件下保存。

然后，将另一块肺组织放入预称重的含有 PBS 的溶血管中，并置于冰上。最后，在腹部左侧做一切口，取出脾脏置于另一含有 1 毫升 PBS 的溶血管中，并将该管置于冰上。

通过鼻内接种每只小鼠五次十的五次方CFU的白色念珠菌，可获得持续四天的模型。在这四天期间，小鼠体重增加，但不表现出肺损伤。然而，随着接种菌落形成单位（CFU）的增加，肺损伤也随之加重。

感染后24至36小时观察到肺损伤达到最严重程度。相比之下，细菌负荷每24小时减少1 log CFU/毫升，且每日观察到细菌播散程度逐渐累积增加。从感染小鼠采集的支气管肺泡灌洗液中可见大量中性粒细胞被募集，细胞分类计数显示浸润的免疫细胞群体中90%为中性粒细胞，10%为巨噬细胞和淋巴细胞。

完成此操作后，可采用其他方法（如支气管肺泡灌洗液分析）来进一步探究炎症反应的特征。观看本视频后，您应能够充分掌握铜绿假单胞菌定植模型的建立方法。请务必注意，操作发光型念珠菌时可能存在极高风险，因此在进行该操作时，必须始终采取预防措施，例如穿戴防护装备以避免液滴污染。