使用光化学血栓技术建立局限性囊膜梗死模型

该技术的总体目标是利用光化学血栓法建立一种具有持续性运动功能障碍的局限性内囊梗死模型。在建立内囊梗死模型之前，需通过将表达绿色荧光蛋白（GFP）的腺相关病毒注入运动皮层的前肢区域，以确定内囊中的前肢代表区。首先，将麻醉后的大鼠固定于立体定位仪中。

然后剃除大鼠头部的毛发，并使用70%酒精和聚维酮碘溶液对头皮进行消毒。在计划切口的头皮区域皮下注射2%盐酸利多卡因，以减轻术中疼痛。涂抹眼用软膏以防止眼睛干燥。

在动物身上覆盖无菌手术巾。在头皮正中做一道两厘米长的切口后，调整立体定位仪臂，根据立体定位坐标确定运动皮层的前肢区域，并在此位置钻一个入颅孔。

将针头移至钻孔位置，并穿过硬脑膜向下推进1毫米，进入运动皮层。使用高精度微泵缓慢注入1 µL病毒。针头在原位保留额外10分钟，以防止液体沿针道回流。

10 分钟后，缓慢拔出针头。用生理盐水冲洗手术部位后，使用 3-0 尼龙缝线缝合伤口。然后将大鼠从立体定位仪上取下，转移至恢复室进行监测。

给予镇痛药以控制术后疼痛。术后两到三周，按照批准的方法处死大鼠，并对经冷冻保护的大脑进行切片。经GFP染色后，使用荧光显微镜观察内囊中AAV-GFP转导的轴突。

将荧光图像中观察到的转导轴突位置与大鼠脑图谱进行比对，以准确确定转导轴突的立体定位坐标。准备光学神经接口时，首先使用切割钻截取一段长约四厘米的27号带芯脊髓穿刺针。然后剥离一段长约10厘米的光纤护套。

将无护套的光纤段插入金属管中，并将金属管夹紧在光纤上。然后使用压接工具在金属管下半部分压接两次。

金属管填充在光纤与脊髓穿刺针针座之间的空隙。在光纤上涂抹可热固化的环氧树脂，并在针座的空余空间内添加额外的环氧树脂。

将光纤插入脊髓针中，在100摄氏度下固化环氧树脂20分钟以实现稳定固定。固化后，截断从脊髓针中伸出的光纤，然后使用金刚石研磨片对脊髓针尖端处的光纤进行抛光。

最后，将光纤跳线的 FCPC 连接端连接至绿光激光系统的耦合器。然后使用数字式光学功率和能量计测量光纤尖端的光强度，以确保光的准确发射。在动物身体下方放置加热垫，以维持手术过程中动物体温在 37.5 摄氏度。

首先，按照之前的方法对大鼠进行麻醉并做好手术准备。在正中线做2厘米长的切口后，调节鼻夹的高度，直至前囟（Bregma）与后囟（Lambda）处于同一水平面。正确的对齐对于准确靶向内囊至关重要。

将立体定位仪的机械臂定位至光栓塞部位，随后在此处钻一个直径两毫米的孔。接着，抛光并清洁ONI的光纤尖端，然后将其固定在立体定位仪框架上，避免弯曲。

检查ONI的尖端，确保其清洁且完好无损。在将光学接口插入大鼠脑部靶位点之前，测量光纤尖端的激光强度。调节激光强度，使光纤尖端的输出功率为3.5毫瓦。

现在，使用本方案第一部分确定的背腹向坐标，将ONI降低至内囊的目标区域。随后，通过尾静脉注射2毫克/千克的玫瑰红（Rose Bengal），然后启动一个倒计时计时器，设定为1分钟。1分钟结束后，打开532纳米的绿色激光，持续照射90秒，以形成梗死灶。

辐射后，轻轻将ONI从脑部移除。清洁手术部位后，用3-0尼龙缝线缝合伤口。然后将大鼠从立体定位仪上取下，转移至恢复室。

该图像显示了光血栓形成损伤后两周，在激光光照强度从2毫瓦到5毫瓦范围内，梗死病灶的范围。箭头指示梗死病灶。在此实验条件下，所采用的光学光照强度介于3毫瓦至4毫瓦之间。

以下两张图像显示了光栓塞后三周囊膜梗死的显微外观。在此大鼠脑的冠状切面中，箭头指示了包含光学纤维的针道，该针道穿过丘脑并延伸至内囊。这些连续嵌套的染色切片展示了内囊中梗死病灶的范围。

箭头指示梗死病灶。