通过比率荧光显微镜测量吞噬体pH值

本系列实验的总体目标是利用比率荧光显微镜测量活细胞中吞噬体的pH值。该方法有助于解答吞噬细胞生物学领域中的关键问题，例如鉴定病原体相互作用中的关键分子，或基因扰动及药物对吞噬作用的影响。该技术的主要优势在于，与基于群体的检测方法（如流式细胞术或光谱分析）不同，它能够检测到颗粒结合迁移的变化以及单个吞噬体之间的异质性等效应。

该技术的应用延伸至我们针对致病性微生物的治疗策略，因为许多此类微生物能够改变吞噬体内的pH值，以避免在吞噬体中被降解。开始此操作时，将20毫克干燥的Xan加入10毫升无菌PBS中，涡旋混匀，并在沸水浴中加热10分钟。随后冷却，并在2000 ×g 条件下离心5分钟。

随后，弃去上清液，并将Xan重悬于1毫升PBS中。在水浴中超声处理10分钟。超声后，将重悬的Xan溶液各500微升转移至两个1.5毫升离心管中，并在11,000 ×g条件下离心5分钟。

用500微升PBS重复洗涤一次。然后用500微升新配制的pH 9.3、0.1摩尔碳酸钠溶液将Xan洗涤两次，最后一次洗涤后将Xan重悬于490微升碳酸钠溶液中。随后，向Xan涡旋液中加入10微升溶于DMSO的FZ溶液（浓度为10毫克/毫升）。

用锡箔纸覆盖，在室温下振荡孵育四小时。为去除未结合的染料，首先用 0.5 毫升 DMSO 加 150 微升 PBS 洗涤，并在洗涤步骤之间进行超声处理。接着用 0.5 毫升 DMSO 加 300 微升 PBS 洗涤，然后用 0.5 毫升 DMSO 加 450 微升 PBS 洗涤，最后用 PBS 单独洗涤。之后，将一微升 Xan 加入 500 微升 PBS 中，并涡旋混匀。

然后将10微升稀释的xma沙液滴加到血细胞计数板小室边缘与盖玻片相接处，将血细胞计数板安装在配备20倍物镜的明场显微镜上。聚焦于含有16个方格的左上角区域，计数该区域内的所有xma沙颗粒。使用手动计数器，在右下角区域重复此操作。

然后使用该方程计算 Xan 的浓度。接下来，用兔抗 Xan 抗体以 1:100 的稀释度对标记的 Xan 进行调理，在旋涡混合器中混匀，并将样品在 37°C 水浴中孵育 1 小时。随后使用血细胞计数板对 Xan 颗粒进行计数，然后稀释至每毫升 100 × 10⁶ 个颗粒。

分离小鼠原代中性粒细胞后，将 2 × 10⁵ 个中性粒细胞加入 35 毫米玻璃底培养皿中央。随后加入 50 µL 培养基分散液滴，并在 37 °C 下孵育 5 分钟，使细胞贴壁。之后，加入 1 mL 预热至 37 °C 的 HBSS，其中含有髓过氧化物酶抑制剂。

将培养皿安装在配备37摄氏度加热系统和40倍油镜的宽场荧光显微镜上。在不进行成像的情况下孵育细胞10分钟，使细胞和设备达到平衡。随后，调整显微镜设置，每30秒获取一次明场透射图像，并使用440纳米或490纳米激发光和535纳米发射光。

两分钟后，将10个10倍的六氟化沙加入培养皿中央，并继续成像30分钟。30分钟后，停止延时成像并启动计时器。移动载物台，在五分钟内于不同视野中采集10个或更多快照，以成像其他vaga区域。

在此步骤中，将校准溶液解冻，并在水浴中升温至 37 摄氏度。使用 pH 计检测 pH 值并记录。接着在图像采集前，将蠕动泵安装到玻璃底培养皿上。

然后在30分钟采集期结束时进行活细胞视频显微观察。打开泵以移除培养皿中的溶液。随后加入一毫升第一种校准溶液，并关闭泵。

等待五分钟，直至信号稳定。使用每种校准溶液重复该步骤。为分析延时电影和吞噬体快照，使用ImageJ打开图像。在无细胞区域绘制一个小方形感兴趣区域（ROI），对490通道进行背景扣除。

使用方形多边形选择工具并点击插件，然后进行背景减除。通过点击编辑，将相同的 ROI 上传到 440 通道。

然后进行选择，接着恢复选择，并重复背景扣除步骤。首先点击“处理”，然后选择“图像计算器”，对490通道除以440通道生成一个32位的比值图像。

随后，在“图像一”和“图像二”下拉菜单中选择适当的图像。在操作下拉菜单中选择“除法”，并勾选“32 位结果”复选框。然后，通过点击“图像”，再点击“上表”，将颜色编码查找表更改为与比率兼容的颜色编码。

然后选择彩虹 RGB 模式。通过单击图像设置比值图像的阈值，以消除零值和无穷大像素，随后进行调整并应用阈值。

调节滚动条，使 Xan 显示为红色，然后单击应用，并确保已选中“将背景像素设置为 nan”的复选框。如果背景和 Xan 信号值产生的比值非常接近，导致比值图像噪声较大，可通过单击“处理”，然后选择“数学运算”，向 440 通道重新添加少量背景。

然后添加，再重新生成比值图像以获得更清晰的结果。或者，可省略440通道的背景扣除。接下来，通过点击图像颜色，将该比值图像序列与明场通道合并为一个多通道复合图像。

然后合并通道。在灰色通道的下拉菜单中选择明场图像，在绿色通道的下拉菜单中选择比率图像。接着选中“保留源图像”复选框。

随后，扫描明场与比率通道的时间序列图像或快照，以确定需要分析的吞噬体，使用椭圆多边形选区工具在吞噬体周围绘制感兴趣区域（ROI），并通过点击分析工具，然后选择 ROI 管理器，再点击“添加”将其加入 ROI 管理器。对于时间序列图像，通过点击“更多多重复测量”来测定其 Xan 荧光强度比率，并取消勾选“每层一行”复选框。

通过绘制ROI类型为控制M的区域，一次跟踪一个FGA区域，以测量每个时间点的荧光强度，并在必要时移动ROI，以随时间跟踪强度值。然后将结果窗口中的测量值复制到电子表格中，将荧光信号转换为pH值。在电子表格中测量校准时间序列影片中吞噬体的490/440比值后，绘制该比值随时间变化的曲线图。

然后，在每个 pH 校准溶液对应的时间段中点处的五个时间点，计算视野内所有吞噬体的平均比值。将至少三次独立校准实验获得的平均 490/440 比值与实际测得的 pH 值合并，绘制于同一张图中。随后进行非线性回归分析，以获得将比值转换为 pH 的方程。

该图展示了如何区分吞噬体和摄入的Xan。左侧面板显示了明场图像与490至440 Fitz zy比值图像的合并结果，而右侧面板仅显示明场图像。

吞噬体可与外部颗粒区分开来，这些外部颗粒要么不与细胞共定位，要么其荧光特征与明场图像中吞噬体典型的“亮环环绕暗中心”结构不相符。以下是野生型和HV CN1基因敲除型中性粒细胞吞噬体pH值的典型时间变化过程：在野生型中性粒细胞中，早期时间点的吞噬体pH值呈中性或轻微碱性；而在HV CN1基因敲除型中性粒细胞中，吞噬体在吞噬后可能呈碱性或酸性。在加入靶标后30至35分钟拍摄的图像，可基于此处所示Fitz Xan比值的直方图，从大量吞噬体中计算出群体平均的吞噬体pH值。

我们可以观察到野生型与HVCN1基因敲除中性粒细胞之间微小的pH差异。一旦掌握，该技术可在六小时内完成。从优化步骤开始进行此操作时，重要的是要记住优化成像条件。首先，在优化步骤中优化抗体浓度也有助于确保吞噬作用的可靠性。遵循此操作流程。

还可以采用其他方法，例如检测罗斯体（Ross）的生成或测定细菌杀伤能力，以回答进一步的问题，例如在吞噬体形成后，其内罗斯体的生成量或吞噬体杀灭细菌的能力是否伴随 pH 值的变化而发生改变。该技术为吞噬细胞生物学领域的研究人员探索影响吞噬细胞杀灭或处理摄入物质能力的因素，以及如何进一步引发免疫应答，奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何开展几何荧光显微镜实验，以实时测量活细胞中吞噬体的生理参数。

请注意，使用UNIFOR抑制剂和活细胞操作可能具有极高的危险性，因此在进行该实验步骤时，必须采取佩戴手套等防护措施。