使用条件性 Cre-lox 小鼠模型分析潘氏细胞在小鼠肠道再生中作用的实验方案

本解剖操作的总体目标是演示如何分离并制备小鼠肠道，以用于后续的表征技术。该方法可用于研究肠道干细胞在实验操作后重新定植肠道的能力。该技术的主要优势在于，可在任何技术处理、任何操作过程或基因操作（使用Cray locks技术）之后应用。首先将一只已处死的成年小鼠置于仰卧位，并用70%乙醇润湿其毛发。

然后使用剪刀沿腹中线纵向切开腹腔，并用镊子固定胃部。接着切断胃与食管的连接，轻拉胃部以取出直至阑尾的小肠。然后轻拉阑尾，取出直至肛门的大肠。

肠道分离后，去除附着在盲肠上的胃组织，并立即使用装有钝头移液管尖的注射器以 PBS 冲洗肠道。冲洗后，将肠道切成长度相等的三段，分别为近端、中段和远端部分。然后将每一段切成约 1 厘米长的小段，取三至五块组织碎片放置于一块 2 厘米 × 2 厘米大小的外科胶带中央，呈金字塔形排列。当所有组织碎片放置完毕后，沿纵向将胶带封合，形成类似原木堆叠的结构。

然后将胶带放入平底容器中，容器内含有至少为组织体积10倍的中性缓冲福尔马林固定液，并在包埋和切片前于4°C保存样品。固定后，将组织转移至平底容器中，容器内含有至少为组织体积10倍的70%乙醇，以便在灌流后立即用Metcon固定组织。将肠道按如上所示切成三个等长的片段。

然后将每个切片并排置于一张15 cm × 15 cm的滤纸上，当所有切片均被分开后，使用弹簧弓形剪刀在FOSS中将切片展开。固定结束后，将滤纸转移至含有新鲜配制的Metcon的玻璃皿中，在室温下孵育3至24小时。用镊子依次夹起每段肠组织的一端，将组织缠绕在镊子上，制成独立的瑞士卷状结构。通过略微张开镊子，并将一根25号针头穿入组织中，固定每个卷状结构。

然后将卷好的组织放入平底容器中，容器内需含有至少为组织体积10倍的中性缓冲固定液，固定时间不少于1小时，随后进行整体封片以观察组织破裂情况。将熔融的石蜡与矿物油混合物倒入15厘米的培养皿中。在用预冷的PBS冲洗肠道后，立即用25毫升预冷的ex cal固定液冲洗组织。

固定后，将肠管切成三到五个等长的节段，每个节段放置在一块冷却的蜡板上。用针固定每一端，使节段略微拉伸，并将肠系膜缘置于蜡板上方。修剪掉多余的肠系膜组织。

然后使用弹簧剪纵向剪开肠道，并在打开时用大头针固定，待所有组织段均固定后，加入足量的 Xal 固定液以完全覆盖组织，于 4 摄氏度下放置至少 1 小时。使用 25 毫升移液管或注射器吸除固定液，并用 30 毫升 PBS 清洗组织一次。

然后加入 30 毫升 DTTD 裂解液覆盖组织，在室温下振荡孵育 30 至 60 分钟。孵育结束后，用 25 毫升移液器或注射器吸去裂解液，并用另一份 30 毫升 PBS 浸洗组织。随后使用移液器在洗涤后吸除含有黏液的 PBS。

用 30 毫升 xal 替换 PBS，在室温下避光、于摇床上轻轻振荡过夜染色。次日早晨，若切片已呈现蓝绿色染色，则用 30 毫升 PBS 替换 xal。轻轻振荡 3 分钟后，按前述方法制备瑞士卷，并将组织置于宽口平底容器中，容器内含有至少为组织体积 10 倍的适当固定液，在 4°C 下固定至少 24 小时，然后再进行包埋和切片。

利用ROSA 26 R Laxy条件型报告基因系统，从小肠中提取重组隐窝的DNA，可在诱导后三天观察到100%的重组效率。对重组等位基因进行qPCR检测显示，VI crease系统中重组水平有所增加，但无统计学显著性，这可能归因于潘氏细胞中的重组未被检测到。使用Laxy报告基因的ah crease系统显示，两种系统在诱导后三天均出现重组细胞的完全丢失。

有丝分裂和隐窝细胞高度数据表明，ah H Cree 系统能够恢复，可能是由于未结合的肠干细胞重新定植所致。相比之下，尽管 villain Cree 仍保留了肠上皮隐窝细胞，却未能恢复。此外，vi Cree Cantin B flocked 小鼠的隐窝细胞无增殖活性，且不表达肠干细胞标志物。

EM 四。与 ah cre 小鼠中的隐窝类似，PTH 细胞仅在 VI Cree 系统内发生 Caden b 基因删除后出现凋亡。一旦掌握，该技术可在约 10 分钟内完成。

重要的是尽量减少延迟，以防止组织降解。观看本视频后，您应充分了解如何从小鼠体内取出肠道以进行后续分析。