基于成像和流式细胞术的三维黑色素瘤球体中细胞位置与细胞周期的分析

本方法的总体目标是针对多细胞类固醇中细胞的细胞周期状态及其在类固醇内的位置，实现细胞的识别、表征与分离。与二维细胞培养相比，三维OID模型能够更好地模拟体内肿瘤的生物学特性，因为它重现了肿瘤的结构及其微环境。通过将类球体与流式细胞术和成像技术相结合，该方法可解答癌症研究领域的一些关键问题，例如肿瘤微环境如何改变药物敏感性、细胞运动性及增殖能力。

该方法的主要优势在于能够实时观察细胞周期，并允许从特定的类固醇区域纯化活细胞，从而证明该实验流程的可行性。本操作将由本实验室研究助理A sharp完成。首先准备3D类固醇的形成：将1.5%的aros溶于100毫升Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，间歇性地在微波炉中加热3至5分钟，并不时摇动烧瓶，以确保aros完全溶解。随后立即用移液器将100微升aros溶液加入平底96孔组织培养板的每个孔中。将培养板在室温下孵育1小时，使aros充分凝固。

接下来，从细胞培养箱中取出表达FCI构建体的黑色素瘤细胞，其融合度约为80%。用10毫升HBSS洗涤细胞。加入1.5毫升含0.05% EDTA的溶液，然后在37摄氏度下孵育约两分钟。

待细胞脱落后，将其重悬于10毫升细胞培养基中。使用血细胞计数板和倒置显微镜手动计数细胞，并用细胞培养基将细胞稀释至每毫升25,000个细胞。然后吸取200微升细胞悬液，加入96孔Transwell板的每个上室中进行覆盖。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育约三天，以形成细胞球体。孵育结束后，在倒置显微镜下使用物镜和相差滤光片对球体进行成像。细胞球体应呈现为致密的、大致呈球形的细胞聚集体，用于制备细胞球体切片并进行成像。

使用1毫升移液器将它们转移至一个Falcon管中。然后让类固醇沉淀至锥形管底部。接着通过抽吸去除培养基，并在室温下用10%中性缓冲福尔马林固定类球体，孵育至少两小时。

细胞切片并成像后，SP 可在 HBSS 中于 4 摄氏度保存数天。打开图像分析软件，选择仅定量分析配置。然后创建一个新的库，并通过将原始数据文件拖入库中来导入类球体共聚焦图像文件。

接下来，转到测量选项卡，通过在协议窗口中按正确顺序拖放命令来构建图像分析协议。要在绿色通道中查找目标，可从“查找”部分拖放“查找目标”命令至协议窗口，并选择相应的通道。然后添加位于“处理”类别下的“开运算”命令，再添加一个独立的“分离接触目标”命令以分离细胞。

最后，在过滤部分，根据大小添加并排除对象。设置命令以排除小于 50 微米的对象，从而去除较小的非细胞对象。接下来，将一个新的“寻找对象”命令拖放到方案窗口中。

按照相同的步骤，选择红色通道并应用所有后续命令。找到目标物体后，使用隐藏通道或显示通道命令，直观地确认红色和绿色物体分别对应红色和绿色的细胞核。如有必要，点击“测量”然后选择“反馈选项”，以调整物体掩膜的显示效果。

现在，为了找到对应于早期S期细胞的黄色物体，请使用组合部分中的“相交”命令，选择将红色物体与绿色物体相交。同样，排除面积小于50微米的物体。为了鉴定G1期细胞，请使用组合部分中的“减去”命令，选择从红色物体中减去黄色物体，以获得仅有的红色物体。

类似地，从绿色物体中减去黄色物体，以识别仅与红色物体和绿色物体对应的 SG 期二和 MPH 期细胞的专一性绿色物体。根据需要，通过在过滤部分应用形状因子大于 0.25 的过滤群体命令，去除非细胞物体。然后确定 S 类球状体的轮廓。

在绿色或红色通道中，使用“查找对象”命令从查找部分识别目标。然后使用“处理”部分中的“闭合”命令将各个细胞连接成一个整体对象。接着添加“填充对象中的孔洞”命令，以填补球体中的空隙。

接下来，使用精细滤波器去除 Sphero 对象中的噪声。通过选择按大小排除对象，去除小于 30,000 微米的物体，以完成类球体轮廓的识别。在所有对象定义完成后，从相关部分添加测量距离功能，以确定每个 OID 到 S 类球体轮廓边缘的距离。

请在每一群黄色、单独的红色和单独的绿色群体中执行此操作。为可视化细胞到最近S类球体边缘的最短距离，打开“测量”标签页，选择反馈选项中的“关系”，然后选择“显示距离”。

最后，保存该实验方案以保存由该方案生成的数据。在测量部分选择“生成测量”项。随后，为了解读数据，选中测量项，进入测量部分的分析选项卡，在分析菜单下选择“分析”以统计距离类固醇边缘特定距离处的细胞数量。

通过从分析选项卡中选择滤波器来创建滤波器。例如，仅显示距球体边缘距离小于 100 微米的数据。要导出原始数据，请从文件选项卡中选择导出，然后将数据保存为逗号分隔或制表符分隔的文本文件。

该数据可在电子表格程序中打开以进行进一步分析。由 C 8 1 16 1 生成的细胞球。已用 Fuji 系统转导的人黑色素瘤细胞经过固定并切片。

对AZA绿色荧光（标记细胞周期SG2期的细胞）和Berra橙色荧光（标记G1期细胞）进行共聚焦成像。当这些图像叠加时，可观察到预期的关键特征，例如坏死核心。靠近坏死核心的区域主要为红色的G1期阻滞细胞，而红色与绿色的增殖细胞则随着向类器官外缘延伸呈梯度增加，该区域对氧气和营养物质的可及性最高。

经过半自动图像分析后，可定义 fucci 细胞掩模和 S 类球体的轮廓。使用成像软件对 S 类球体内部或外部区域的红色和绿色细胞进行定量。该分析显示，G1 期阻滞的细胞在内部区域富集，而增殖细胞则主要分布在类固醇边缘附近。

一旦掌握，该技术可在一到两周内完成，该时间范围包括类固醇的培养、成像和分析。按照这些步骤，可将细胞球体植入胶原基质中，然后通过延时显微镜进行成像。随后可对其进行蛋白质或RNA分析，这有助于我们回答诸如细胞球体内的位置以及氧气和营养物质的可及性是否会影响癌细胞表型等问题。