使用 Xenopus 卵母细胞表达系统进行功能克隆

本实验的总体目标是展示一种适用于鉴定能够诱导有反应能力的外胚层产生应答的基因产物的非洲爪蟾卵母细胞与动物帽系统。该方法有助于回答发育生物学领域中的关键问题，例如哪些基因对于引发诱导性反应是必需的。该技术的主要优势在于利用非洲爪蟾卵母细胞作为表达系统，用于产生并鉴定作用于靶组织的诱导因子，甚至可鉴定作用于诱导因子上游的基因。

该方法的可视化演示极为重要，因为解剖和重组步骤高度依赖于发育阶段，且需要精细的技术。从麻醉的雌性青蛙中采集卵巢组织后，将组织撕成小块，每块包含大约10至20个卵母细胞。然后将这些组织片段依次转移至新鲜的OR2溶液中，再转移至含有2.0毫克/毫升胶原酶A的OR2溶液中。随后将含有组织的混合液在摇床上轻轻振荡处理一小时。

然后将组织碎片转移至新鲜的胶原酶溶液中，继续振荡处理1小时。此步骤结束时应观察到去凝聚的卵母细胞。随后用完全OR2溶液洗涤卵母细胞10次，再用卵母细胞培养基（简称OCM）洗涤2次。

随后，将卵母细胞置于新鲜的OCM中，并在解剖显微镜下进行肉眼观察。通过剔除较小的未成熟卵母细胞，分离出处于第六阶段的卵母细胞。接着，将卵母细胞放入含有OCM的琼脂糖包被培养皿中，并在18至20°C条件下保存，直至进行注射。

为进行显微注射做准备，将玻璃毛细管放入拉针仪中，拉制后折断尖端，制备出直径约为20微米的注射针。在复式显微镜下，使用校准的目镜测微尺测量针尖直径。接着，将黏土均匀铺成一层，置于35毫米×10毫米的培养皿底部。

然后使用类似探针的工具在此层中制作平行的沟槽。用约2毫升含3%Ficoll的1x改良巴特氏生理盐水（MBS）填充衬有黏土的培养皿，再用宽口移液管将卵母细胞转移至其中。

将卵母细胞置于凹槽中，以便在后续显微注射过程中固定其位置。使用显微注射仪，用约2 µL预先制备好的mRNA混合液填充注射针，并调节平衡以产生轻微的正压，防止注射过程中卵母细胞的胞质被吸入针内。随后，在卵母细胞的赤道区域注射20 nL的RNA。

随后，将卵母细胞置于Ficoll MBS中孵育一小时，然后轻轻转移至1x MBS中。在20摄氏度条件下继续孵育卵母细胞8至24小时。开始动物帽检测时，准备3/4x正常两栖类培养液（简称NAM溶液）、精细镊子、毛环、先前已注射的卵母细胞，以及处于11至11.5期的非洲爪蟾胚胎。

然后，将玻璃盖玻片破碎成大小约为1毫米×2毫米的碎片，并将这些碎片通过火焰灼烧，直至其边缘熔融并变得光滑。接着，如前所述，将黏土压入培养皿中形成单层。然后使用细小的探针在此涂层上制作出单个杯状的凹痕。

继续向培养皿中加入约两毫升的3/4倍浓度NAM溶液。将已注射的卵母细胞转移至其中，放置数个卵母细胞，使每个卵母细胞固定于一个凹陷内。为准备胚胎，将其转移至含有3/4x NAM溶液的培养皿中。

选取部分原肠胚作为外胚层年龄的分期对照，并将其转移至另一含有相同溶液的培养皿中，将此培养皿置于一旁备用。对于将用于动物极帽实验的胚胎，使用两对精细镊子去除其卵黄膜。

随后，将原肠胚转移至盛有卵母细胞的黏土衬里培养皿中。首先，使用两把精细镊子从胚胎上切下动物极帽，注意避免损伤赤道区域组织。采用第一种方法生成重组体时，将动物极帽放置在已置于凹陷处的卵母细胞的动物极半球上，使其内表面与卵母细胞的动物极半球接触。

对多个已注射的卵母细胞重复此过程。为确保这些重组体保持结合状态，在每个重组体上放置一片弯曲的玻璃盖玻片碎片，并施加向下的压力，直至动物极变平且盖玻片接触到黏土。若采用第二种方法生成重组体，可将动物帽和卵母细胞共同置于黏土中单独的凹陷孔内。

确保动物帽的内表面朝向卵母细胞。然后，使用少量黏土延伸部分将两种组织固定在一起。一旦通过任一方法生成了多个重组体，将它们与预留的对照胚胎一同在20摄氏度下培养。

当对照胚胎达到所需阶段时，从重组体中移除盖玻片，并使用镊子和毛环分离动物极帽外胚层。随后将外胚层组织片段和对照胚胎均在MEMFA中固定一小时。然后将其转移至乙醇中，并于-20摄氏度保存该组织。

在此，将若干组卵母细胞分别注射含有逐渐减少数量的克隆或菌落对应的mRNA混合物，然后与动物帽共同培养。随后，检测每组中表达foxe3的动物帽数量，foxe3是一种通常在从早期神经板阶段到囊泡形成期间的预定晶状体外胚层中观察到的标记基因，在本实验中用于评估诱导晶状体形成的能力。该方法鉴定出一个编码核因子的基因ldb1，其可在179个被评估的动物帽中的50个（即28%）中产生诱导晶状体的反应。

如图所示，我们的原位杂交图像显示了在约 11 到 23 期期间，与注射了 ldb1 的卵母细胞共同培养的动物帽中，由箭头指示的 foxe3 信号。而在放置于未注射卵母细胞上的相应对照动物帽中，未观察到 foxe3 表达。当对这些动物帽进行切片时，可在内层和外层外胚层中均检测到 foxe3 的表达。

内层的表达是晶状体反应的特征。或者，若内外两层均有表达，则提示可能存在嗅板等其他结构。完成此操作后，可进一步对动物极帽外胚层进行免疫组织化学、原位杂交或荧光报告基因的直接检测等方法，以评估其诱导反应。