用于通过核磁共振实时测量酶反应速率的溶解动态核极化仪器装置

本实验的总体目标是通过动态核极化增强的核磁共振技术，实时追踪酶促反应过程。利用动态核极化（DNP）增强的液态核磁共振，有助于回答一些关键科学问题：例如，如何在不以任何方式修饰一对分子的前提下，确定这对分子在细胞内或活体内的酶促转化速率。我们实验室成功安装了溶解态DNP设备，同时来自洛桑Arnaud Comment实验室的博士生Riccardo Balzan也已抵达本实验室，这标志着我们的研究迈出了重要的一步。

DNP 显著提高了我们在500兆赫核磁共振波谱仪上可开展实验的灵敏度。这套DNP设备是法国首套安装的设备，我想特别指出，在使该设备投入运行的过程中，我们核磁共振团队的所有成员都参与其中，尤其要感谢我们的研究工程师Gildas Bertho和讲师Fatiha Kateb。该技术的主要优势在于，能够以秒级的时间分辨率对底物及其内源性衍生物进行直接、实时的定量分析。

对于极化溶液，配制2毫升1.12摩尔的碳13标记的丙酮酸钠溶液，其中掺杂33毫摩尔的TEMPO自由基，并使用体积比为2:1的氘代水与氘代乙醇混合溶剂，用于碳13观测。通过点击低温恒温器软件界面上的降温按钮，执行降温程序，降低动态核极化（DNP）低温恒温器的温度。通过填充程序将液氦收集至DNP低温恒温器中。

单击低温恒温器软件界面上的填充按钮。然后将 300 微升优化的极化溶液放入 DNP 极化仪附带的样品容器中。通过将装有样品的容器轻轻浸入液氮浴中，使其冻结。

在冷冻程序结束后，将样本容器从液氮浴中取出并倒置旋转，以去除样本容器中可能残留的液氮。接着，先将样本容器插入样本架中，再将样本架放入冷冻切片机的主插入部，然后将微波波导插入样本架中。

通过启动1 K冷却程序来降低恒温器温度。在恒温器软件界面上点击1 K冷却按钮。打开微波源，并在恒温器软件界面上点击启动微波按钮以照射样品。

将核磁共振控制台检测通道的同轴电缆从波谱仪线圈上断开，方法是将连接器逆时针旋转90度后拔出。将检测通道的同轴电缆插入低温恒温器核磁共振线圈的同轴连接器中。然后将核磁共振控制台电缆的公头连接器插入低温恒温器核磁共振线圈的母头连接器中，并注意对准定位销。

用力按压并将连接器顺时针旋转90度。在低温恒温器位置，使用简单的脉冲-采集序列，以未校准的低翻转角脉冲重复激发，间隔时间为 t 等于5分钟，测量固态下的核磁共振热信号。设置测量后，在软件的命令行中输入 zg，然后按键盘上的回车键。

启动极化程序后，采用与热信号测量相同的步骤和条件，测量固态下的DNP增强核磁共振（NMR）信号。将连接至低温恒温器NMR线圈的NMR控制台检测通道同轴电缆逆时针旋转90度并拔出，断开连接。然后将检测通道的同轴电缆插入波谱仪线圈的同轴连接器中。

将核磁共振控制台电缆的公头插入光谱仪线圈的母头，注意对准定位销。用力推入，并顺时针旋转连接头90度。用含20微克/毫升牛血清白蛋白的反应缓冲液，新鲜配制每毫升含一个单位的兔肌肉乳酸脱氢酶（LDH）溶液。

接下来，将478微升反应缓冲液、2微升LDH溶液和20微升氘代水混合，以实现波谱仪磁场的稳定，即锁定。然后将500微升溶液装入5毫米的核磁共振管中。将转移管连接至一种自动化的定制注射装置，该装置可将超极化溶液与用于转移的氦气分离开。

该设备会自动将500微升的超极化溶液注入样品管中。在溶解前，将装有500微升样品的5毫米核磁共振管置于11.74特斯拉核磁共振波谱仪的等中心位置。在溶解插件的锅炉中加入5毫升重水。

通过点击恒温器软件界面上的“准备加热”按钮，利用电阻丝对氘代水进行加压和加热，直至温度达到约180至200摄氏度。然后点击恒温器软件界面上的“SS操作”按钮，随后从溶解插件中移除微波导管。

将溶解插件向下滑入样品 holder 中。溶解插件必须到达样品 holder 的底部，并用力推紧，以与样品容器形成密封连接，防止重水泄漏到低温恒温器中。按下硬件触发器以启动溶解程序，该程序为预设的、按时间顺序控制的气动阀操作序列。

溶解后立即用注射装置将500微升超极化溶液与置于核磁共振波谱仪中的样品混合。溶解后，通过一系列间隔1.5秒、翻转角为10度的脉冲-采集序列，测量波谱仪中样品的核磁共振超极化信号，以追踪底物和产物的磁化过程。设置好测量参数后，在软件命令行中输入zg，然后按回车键。

当磁化完全弛豫后，通过一系列间隔约三分钟（约相当于3T1）的90度翻转角脉冲-采集序列测量NMR热信号。设置好测量参数后，在软件的命令行中输入zg，然后按回车键。此处通过重复施加10度翻转角脉冲获得的谱图时间进程展示了该技术的灵敏度和时间分辨率。

在鉴定丙酮酸底物和乳酸产物的峰之后，通过代谢物信号积分进行定量分析。通过线性模型拟合产物信号的时间进程来确定酶活性。为验证测量结果，还通过产物与底物信号的比值计算初始反应速率，以评估相同的量。

一旦掌握，若操作得当，可在大约两小时内完成酶活性的完整测定。观看本视频后，您应了解如何制备用于核磁共振（NMR）的高极化底物，将其注入含有酶的溶液中，并利用动态核极化（DNP）增强的NMR技术监测酶活性。在尝试该操作时，务必使用新鲜的酶和共底物仔细配制酶溶液，并避免样品管中出现任何气泡。

随着液体状态下动态核极化（DNP）增强磁共振技术的发展，研究人员现在可以通过测量产物生成速率，来探索底物在多种细胞内的摄取及其酶促转化过程。请注意，操作低温设备和强磁场环境可能具有极高危险性。在进行此类测量时，必须采取预防措施，例如穿戴针对低温物质的个人防护装备，并确认环境中不存在磁性物体。

与传统的核磁共振（NMR）不同，基于溶解动态核极化（dissolution DNP）的NMR最多只能在几分钟的时间窗口内进行实验，具体时长取决于底物以及当前的生命状态。这一限制阻碍了其在二维谱学以上的应用。溶解DNP NMR需要进一步发展，以达到传统多维NMR所具备的灵活性水平。