基于核仁染色质结构的小鼠窦卵泡卵母细胞的分离与鉴定

本实验的总体目标是详细描述根据小鼠窦状卵母细胞的染色质组织特征及其完全支持潜在胚胎发育能力，对其进行表征所需的全部步骤。该方法有助于回答发育生物学领域中的关键问题，例如如何区分并分离哺乳动物卵巢窦状腔室中存在的两种不同类型的窦状卵母细胞：核仁被染色质包围的SN型（surrounded nucleolus）和核仁未被染色质包围的NSN型（non-surrounded nucleolus）。为获取卵巢，首先通过腹腔注射方式，给予3至6周龄雌性小鼠每只2.5国际单位的孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin）。

两天后，在收获前约一小时，将一个无菌培养皿中加入M2培养基，并在第二个培养皿中加入数滴20微升的M2培养基，每滴覆盖1.5毫升矿物油。然后将所有培养皿转移至37°C、5%二氧化碳的培养箱中，使培养基充分平衡。接着，使用无菌解剖剪在第一只激素注射小鼠腹壁皮肤上剪开一个切口，随后剪开其腹膜。

使用无菌镊子将肠道移开，以定位从膀胱起始呈V形的输卵管。在肾脏下方找到卵巢后，夹住一侧输卵管，并在组织底部做一小切口，释放相应的卵巢。重复此操作以获取另一侧卵巢，然后将两枚卵巢置于盛有预平衡M2培养基的培养皿中。

在分离窦卵泡卵母细胞之前，用手指捏住玻璃巴斯德吸管的两端，将其水平置于本生灯火焰上方，以制备玻璃口吸管。当玻璃开始熔化时，将吸管从火焰中移开，并迅速将其两端拉开。用指甲在靠近吸管狭窄处的位置用力剪去多余的玻璃部分，以缩短吸管尖端，使毛细管内径约为100微米。

选择合适直径的移液管非常重要。如果管径过细，卵母细胞会卡住、发生碎片化并死亡。然后将移液管未修改的一端连接到吸液管上。

接着，将卵巢转移至含有1毫升预平衡M2培养基的培养皿中，使用无菌胰岛素注射针头轻轻穿刺卵巢的窦状卵泡。当卵母细胞释放后，用口吸管轻柔地收集，注意避免吸入任何卵泡细胞或其他组织碎片。然后迅速将每个卵母细胞依次通过多个预平衡的M2培养基液滴，以去除附着在卵母细胞透明带上的所有卵丘细胞。

卵母细胞去除卵丘细胞后，小心地将卵母细胞沉降至新鲜平衡M2培养基独立液滴的底部。为染色卵母细胞，使用口吸管将细胞转移至含有Hoechst 33342的20微升液滴中（Hoechst 33342用M2培养基稀释）。随后，将卵母细胞转移至一个新的培养皿中，该培养皿内含有覆盖石蜡油的5微升M2培养基液滴，并注意将每个卵母细胞单独沉降至各液滴底部。

当所有卵母细胞转移完毕后，将培养皿置于荧光显微镜下，仅需短暂激发细胞，以观察核仁周围是否存在荧光环。注意避免过度曝光，因为染色质可能受损，若曝光时间过长，卵母细胞可能死亡。在鉴定出SN型和NSN型卵母细胞后，根据其染色质的组织状态，将细胞分选至相应含有适当试剂的培养皿中，用于后续分析。

染色质组织的Hoechst 33342染色可能是该实验流程中最关键的步骤。激发5到10秒的时间足以根据每个卵母细胞核仁周围是否存在染色质来对卵母细胞进行分选。一旦掌握该技术，若操作得当，整个过程可在三小时内完成。

进行该操作时，重要的是要在室温下进行，并注意轻柔处理卵巢和卵母细胞。完成该步骤后，卵母细胞可用于体外成熟和体外受精。该技术建立后，为发育生物学领域的研究人员解答了一个尚未解决的问题铺平了道路：如何识别并区分存在于哺乳动物卵巢中的两种窦状卵母细胞。

观看本视频后，您将充分了解如何制作和使用自制的口吸管，以及如何通过 Hoechst 33342 染色法分离和筛选窦状卵泡中的卵母细胞。请务必注意，操作动物和细胞时需要采取特殊预防措施，例如穿戴个人防护装备并使用灭菌器械。