利用混合反义寡核苷酸在犬X连锁肌营养不良模型中实现多外显子跳跃

本实验的总体目标是评估使用反义寡核苷酸（AON）鸡尾酒疗法在杜氏肌营养不良症（DMD）犬模型中实现多外显子跳跃的疗效和毒性。该方法有助于回答反义外显子跳跃治疗转化研究中的关键问题，例如反义寡核苷酸是否能够在大型动物模型中诱导多外显子跳跃并恢复抗肌萎缩蛋白的表达。使用犬模型进行研究的主要优势在于，较大动物中的治疗结果可更可靠地外推至DMD患者。

尽管外显子跳跃是一种对杜氏肌营养不良症（DMD）极具前景的疗法，但它也可应用于其他遗传性疾病，例如先天性肌营养不良症和肢带型肌营养不良症。体外实验将由本实验室主任青木义恭博士（Dr. Yoshitsugu Aoki）演示，体内实验将由本部门博士后研究员仓冈睦希博士（Dr. Mutsuki Kuraoka）演示。根据文本方案设计反义寡核苷酸（AON）后，使用6孔板，在每平方厘米接种1至5 × 10³个CXMD成肌细胞，每孔加入3毫升含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（pen-strep）的DMEM培养基。

将细胞在37摄氏度下孵育，直至细胞融合度达到60%至80%。当细胞达到所需融合度时，使用低血清培养基将阳离子脂质体转染试剂稀释至总体积100微升，并在室温下静置30至45分钟。随后，用低血清培养基将AONs稀释至终体积100微升。

将稀释的转染试剂与稀释的反义寡核苷酸（AONs）混合，在室温下孵育10至15分钟。在此期间，移除细胞中的培养基，并用新鲜培养基洗涤细胞三次。接着，向转染混合物中加入0.8毫升培养基，然后将整个溶液加入 freshly washed 细胞中。

在37摄氏度下孵育三小时。然后向细胞中加入分化培养基（DM），并继续孵育最多10天以诱导分化。从第3天左右开始，检测分化情况。

为进行吗啉寡核苷酸转染狗成肌细胞，请按照本视频前面演示的方法培养CXMD成肌细胞。将混合的吗啉寡核苷酸在65摄氏度加热10分钟。然后加入肽类递送试剂，并将吗啉寡核苷酸调整至终浓度为3至6微摩尔。

接着，使用 DM 更换成肌母细胞的培养基，并将吗啉代寡核苷酸以终浓度 1 µM 添加至每个孔中。孵育 16 至 18 小时。然后，为收集细胞进行 RNA 提取，向细胞中加入 1 mL 异硫氰酸胍-苯酚-氯仿溶液，使细胞从培养板上脱落。

室温孵育细胞10分钟后，将细胞转移至1.5毫升离心管中。每管加入200微升氯仿，室温孵育2分钟，直至出现三层分离：RNA层、蛋白质层和DNA层。在4°C、12,000 × g条件下离心15分钟。

然后，移除上层上清液，并转移至含有 500 微升异丙醇的离心管中。在弃去上清液并保留 RNA 沉淀之前，先对上清液管进行离心。用乙醇洗涤沉淀，并在 4°C 条件下以 8,000 × g 离心 5 分钟。

将离心管倒置15分钟，以挥发残留的乙醇，然后加入15至30微升无RNase的水。接着，使用260纳米处的紫外-可见光谱法对RNA进行定量。进行RT-PCR时，混合以下试剂，并加水至终体积为25微升。

将样本放入热循环仪中，并运行以下程序。程序结束后，将产物储存在 4 摄氏度或 20 摄氏度条件下。进行肌肉内注射时，在按照文本方案准备动物并实施麻醉后，使用手术刀在胫前肌（CT）区域沿纵轴方向切开皮肤约五厘米。为标记注射位点，使用手术针和缝合线在深筋膜上缝合两个间距为两厘米的缝合标记。

用缝合线标记注射部位非常重要，这有助于更准确地进行活检。接下来，使用27号针头将所需浓度的AONs注入肌肉，并将针头留置一分钟。然后，进行开放性肌肉活检时，使用外科手术刀从CT肌肉中切除一段长约两厘米的肌肉组织。

将肌筋膜复位覆盖于肌肉上，使用000号可吸收缝线缝合组织。然后，使用000号尼龙缝线缝合皮肤。用针头给予盐酸布托啡诺0.02毫克/千克的肌肉注射。

按照文本方案固定动物后，将静脉留置针插入肢体静脉，注入含有等量每种反义寡核苷酸（AON）的混合制剂。使用输液泵或注射泵，按照制造商说明，在20分钟内以每分钟2.5毫升的速度共注入50毫升。根据方案每周或每两周重复注射一次，因重复注射可使抗肌萎缩蛋白表达逐渐累积。

为进行每周血液检测以评估毒性，使用针头从动物前肢或后肢的皮下静脉采集三毫升血液。根据试剂盒制造商的说明，进行以下检测项目。其他进一步的分析请依照文本方案执行。

为了比较每种AON的有效性，将成肌细胞转染了不同的2'OMePS处理条件。此处所示凝胶代表处理后四天收集的RNA的RT-PCR样本。凝胶上位置较高的条带表示阅读框外的DMD产物，在未经处理的Ex8A和Ex8B处理的成肌细胞中均可见。

Ex6A、Ex6B、Ex8A 和接受鸡尾酒疗法处理的成肌细胞均显示出框内产物。cDNA 测序证实外显子 6 至 9 已被跳过。如本图所示，免疫细胞化学结果显示，与未处理样本相比，接受反义寡核苷酸处理的狗细胞中抗肌萎缩蛋白阳性纤维数量增加。

为了比较不同AON治疗条件的疗效，将CXMD犬分别注射Ex6A，或Ex6A、Ex6B和Ex8A的混合物，剂量各异。DYS1染色的肌肉样本显示，接受混合物治疗的样本中抗肌萎缩蛋白表达增加，且抗肌萎缩蛋白阳性纤维随抗肌萎缩蛋白剂量的增加而增多。系统性注射后，与未经治疗的CXMD犬相比，接受混合物治疗的CXMD犬在胫骨前肌（CT）和心肌样本中均显示出更高的抗肌萎缩蛋白表达水平。

然而，与治疗后的心肌相比，经AON处理的骨骼肌中抗肌萎缩蛋白的表达水平要高得多。此外，与未经治疗的CXMD犬相比，经治疗的CXMD犬在组织病理学上有所改善，表现为中央核纤维显著减少。一旦掌握技术，体外和体内实验若操作得当，均可在数小时内完成。

在进行该操作时，必须密切监测犬的健康状况。系统性外显子跳跃技术的建立，为该领域的研究人员在杜氏肌营养不良症（DMD）患者中开展临床试验奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用反义寡核苷酸治疗犬类动物。