从土壤中根系的三维X射线计算机断层扫描数据中提取根系参数：体积与表面积分析

本实验的总体目标是从土壤中的X射线计算机断层扫描数据中提取植物根系的定量信息。这种研究活体植物根系结构的方法有助于回答生物学领域的一些关键问题，例如植物如何响应干旱、微生物活动等环境变化。该技术的主要优势在于其非侵入性，因此能够让我们在植物的自然生长环境——土壤中对其进行研究。

该方法的可视化演示非常有价值，因为该过程涉及多个步骤，包括断层成像、数据重建和分析，若无视觉辅助，这些步骤可能难以理解。首先，将一盆植物放置在X射线断层扫描仪的样品操纵器上，调整至所需目标放大倍率对应的距离。对于直径为两英寸的容器中的植物，将样品与光源的距离设置为约三英寸。

在仪器控制软件中，将X射线功率设置为85千伏和190微安。然后，将曝光时间设置为1秒，以获得更好的信噪比。将投影数量设置为3,142，每个投影的帧数设置为4，以获得良好的数据统计结果。

使用刚刚设置的扫描参数，选择“明暗校正”选项卡。然后点击“新建”，并为明暗校正文件命名。接着点击“确认”以保存新的设置条件。

接下来，单击“创建”并单击“确定”以使用两张参考图像。然后单击“生成”。当警告弹窗出现时，在单击“确定”前需将样品从光束路径中物理移除。此时，阴影校正将开始运行。

现在，点击“Acquisition”选项卡。为数据文件命名，然后为X射线滤光片选择“None”。确保勾选“Minimise ring artefacts”复选框，以便在采集投影图像时，样品能够以角度步进方式旋转。

最后，单击“Acquire”按钮开始扫描。获取原始数据后，将其载入重建程序中。通过单击“Blink”来比较第一幅和最后一幅图像，以确保样品在数据采集过程中未发生移动，且扫描参数未发生变化。

通过选择“旋转中心”选项卡，并使用“自动”旋转中心查找功能，设置“高”精度和“双切片”选择来计算旋转中心（COR）。然后，单击“开始”以运行计算。找到旋转中心后，单击“体积”选项卡以选择待重建的样本。

使用缩略图编辑体积选择窗口，然后单击“开始”以执行重建，生成包含三维数据的体积文件。为准备可由RooTrak处理的图像堆栈，请通过单击“文件”、“导入”、“原始图像”，然后选择体积文件，将该体积文件加载到ImageJ中。

为了优化根系与土壤之间的图像对比度，请点击“图像”选项卡，然后选择“调整亮度/对比度”并点击“自动”。当目标区域在图像中清晰可见时，即表示设置已达到最佳状态。通过点击“另存为”并选择“图像序列”，将图像以 JPEG、BMP 或 PNG 格式保存为图像堆栈。

为了在RooTrak中进行根系分割处理，请选择“工具”选项卡并选择“追踪器”。然后双击对话框中的白色输入区域以加载图像序列。图像加载完成后，选择“追踪器”选项卡，并通过在体数据顶部切片视图中可见的各个相关根区段内部单击多个点，在根内设置种子点。

将追踪器参数的平滑度设为 0.3，相似度设为 0.8。点击“输出目录”下方的输入框以选择一个文件夹，然后点击“选择文件夹”，再点击“开始”。

随后将运行追踪功能，该功能会从顶部图像切片开始，一直追踪到最底部的切片。打开并查看体数据后，根据可用的数据体积选择切片数量。

在此示例中，追踪在200个切片处停止，相当于深度达到6.2毫米，此时根系边界变得模糊不清。要在ImageJ中进行体积和表面积分析，需将RooTrak生成的图像堆栈转换为二值图像格式，方法是选择“Process”（处理）、“Binary”（二值化），然后选择“Make Binary”（创建二值图像）。使用开源ImageJ插件BoneJ通过选择“Plugins”（插件）、“BoneJ”，然后选择“Isosurface”（等值面）来生成三角网格。

在打开的选项窗口中，将“重采样”和“阈值”分别设置为六和120。然后，勾选“显示表面”，并点击“确定”按钮。在打开的3D查看器中，点击“文件”选项卡。

然后点击“导出表面”并以STL二进制格式保存。最后，打开IMESHJ，通过点击“选择STL文件”加载STL文件，并输入体素尺寸（单位：微米）。

单击“输入体素大小”，输入31微米，然后单击“确定”两次。单击“计算表面积”以获得样本总根系表面积（单位为平方毫米）。然后，单击“计算体积”以获得样本总根系体积（单位为立方毫米）。

该样本包含原生草种草原落芒草（Sporobolus heterolepis）的两个茎秆及其周围的原始土壤，如图所示。重建数据生成的体素尺寸约为31立方微米。在生成图像序列并增强根系与土壤之间的对比度后，重建数据显示根系和部分土壤成分的X射线衰减系数非常接近，导致图像中灰度对比度极低甚至无法分辨。

该图显示了在体数据顶层切片中可见的相关根部区域内选择的一个代表性种子点。使用本视频中描述的 RooTrak 参数，RooTrak 成功分割了约 200 层体数据切片，相当于 6.2 毫米的深度。本动画还演示了根部的分割过程。

此处使用 ImageJ 对 RooTrak 生成的数据创建三维体数据的三角网格等值面。采用默认设置可快速生成细节丰富的等值面。最后，通过 IMESHJ 计算得到表面积为 351.87 平方毫米，体积为 47.27 立方毫米。

一旦掌握，若操作得当，该流程可在五小时内完成。在尝试该技术时，重要的是牢记遵守所有安全规程。还需注意，只有当根系与土壤之间存在足够的X射线对比度时，才可能实现根系分割。

通过该方法，其他具有分支结构的样本（如树叶、动物和人类的肺等）也可进行成像和分析，以回答更多科学问题，例如活体组织如何生长或如何耐受特定环境条件。该技术的建立为植物科学领域的研究人员探索模式植物（如短柄草）的抗旱性等特性提供了新的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用断层扫描技术对植物样本进行成像，如何可视化其根系结构，并从土壤中的X射线计算机断层扫描数据中提取根系的定量信息。

请勿忘记，使用X射线仪器可能存在危险，在进行此项技术操作时应遵循相关的安全规程。