一种简化的大鼠原代海马神经元超低密度长期培养方法

本实验的总体目标是建立健康且可长期培养的原代小鼠海马神经元超低密度培养体系，以方便进行免疫细胞化学标记以及神经元细胞自主性机制的研究。该研究有助于理解神经科学领域中的一些关键问题，例如蛋白质在神经形态学及发育功能中的特异性研究。该技术的主要优势在于，无需胶质细胞饲养层的支持，即可使神经元在盖玻片上以超低密度生长。

本实验操作将由我实验室的学生 Mariel Piechowicz 进行演示。准备两块高密度和两块低密度的24孔板。使用28号针头在24孔板底部进行划痕处理，使产生的塑料突起可作为支撑，用于承载生长有低密度神经元的盖玻片。

将无菌的玻璃盖玻片转移至指定用于低密度培养的两个24孔板中。用300微升以硼酸盐缓冲液稀释的0.1毫克/毫升多聚-D-赖氨酸对全部四个板进行包被，并放回培养箱中过夜孵育包被。在组织采集前，准备两个10厘米的培养皿，内盛冰上预冷的无菌HBSS。

在显微镜下，用镊子夹住胚胎的颈部，于小脑水平下方的正中线上进行第一刀切割。随后，在颅底左侧进行第二刀切割。接下来，在颅底右侧进行第三刀切割。

在颅骨前端保留一小部分颅骨骨组织和皮肤组织不进行切割，以便于将整个脑组织翻转并轻松取出。随后将脑组织转移至HBSS溶液中。检查脑组织，确保其完整，无明显缺损区域。

然后，重复上述操作，将剩余的胚胎脑组织收集到一个新的培养皿中，该培养皿内含有20毫升冷的HBSS缓冲液。将每个脑组织腹面朝上放置。用镊子夹住脑组织尾端固定，同时用尖头镊子从头侧中点斜向尾侧颞区进行剪切。

对另一侧半球重复此操作。随后，将两侧带有完整海马体的半球与其余脑干组织分离。对所有脑组织重复上述操作，并将所有分离出的半球合并在一起。

然后使用两把镊子去除脑膜。辨认正在发育的海马体，其为折叠于颞叶内部的弯曲结构，并将其与相邻的皮层组织分离。收集并合并所有海马体组织。

在此步骤中，将所有分离的海马体转移至含有酶消化液的15毫升锥形管中。接着，将管子放入水浴中，在37摄氏度下孵育25分钟。25分钟后，小心移除酶溶液。

然后加入 5 毫升温热的洗涤液，使总体积达到 10 毫升。通过缓慢倒置离心管 5 次，轻柔地洗涤组织。移除洗涤液，并再次加入 10 毫升洗涤液，进行额外洗涤。

随后，移除洗涤液，并再次加入三毫升新鲜的温洗涤液。用手剧烈振荡试管15次，以使消化后的神经元从组织中脱离。当细胞从组织中分离并进入洗涤液后，液体应变得浑浊。

然后，将细胞悬液收集到一个新的15毫升锥形管中，同时将剩余的组织留在原管中。接着，向组织中加入另外2毫升洗涤液，用塑料移液管轻轻吹打15次，以进一步分离残留的组织。将细胞悬液静置5分钟后，收集上清液并转移至另一个含有先前收集的振落细胞的新15毫升锥形管中。

然后，使用血细胞计数板对神经元密度进行计数。计算获得每毫升含 250,000 个神经元所需的细胞悬液体积，并将其加入两个含有 30 毫升完全培养基的锥形管之一中，制备高密度神经元接种培养基。取 1.2 毫升该高密度神经元溶液转移至另一份 30 毫升完全培养基中，使终浓度为每毫升 10,000 个神经元，并用此溶液接种低密度细胞爬片。

在此步骤中，将底部刻蚀的24孔板用于高密度神经元置于培养罩内。用真空泵吸除300微升预平衡培养基，然后加入0.6毫升高密度细胞悬液，细胞密度为每毫升250,000个神经元。将另外两个载玻片置于24孔板中，并放入培养罩内。

在将低密度细胞悬液以每毫升10,000个神经元的浓度接种到盖玻片上之前，先用真空法吸除300微升预处理培养基。随后，将全部四个24孔板放回培养箱，孵育2小时。之后，将带有贴壁神经元的低密度盖玻片翻转至高密度培养物上，并确保神经元相对接触。

随后，将两块共培养板放回培养箱中。在DIV 5时，通过每孔加入300微升新鲜饲养培养基对共培养物进行换液。在此首次换液之后，每周向每孔加入300微升不含阿糖胞苷的新鲜饲养培养基。

若培养时间超过一个月，应从超过一个月的时间点开始，每周更换一半新鲜的培养基。形态学上，高密度和低密度神经元均应保持健康状态，最长可达三个月。此处采用免疫细胞化学染色法，通过双标染色显示功能性的谷氨酸能突触，其中NMDA受体亚基NR1与载脂蛋白E受体亚基GluR1被标记。

功能突触可通过ImageJ软件轻松识别和定量。低密度神经元还可使用针对树突蛋白标志物MAP2和轴突蛋白标志物p-Tau的抗体进行双重标记。这种双标方法可清晰区分树突和轴突。此外，尽管转染效率在后期通常非常低，但低密度培养的神经元也可成功利用磷酸钙法转染DNA质粒。

该图说明，EGFP转染可揭示神经元形态，并使精细的树突棘结构可见。最后，作为概念验证，可在促进自突触形成的条件下培养超低密度神经元。通过本共培养方案，将超低密度的自突触神经元种植于聚-D-赖氨酸包被的微岛表面，可由高密度饲养层神经元维持存活超过两个月。

如果操作得当，掌握该技术后可在细胞培养当天的两到三个小时内完成。在进行该操作时，用多聚-D-赖氨酸包被玻璃盖玻片和24孔板底部至关重要。对孔板底部进行简单的蚀刻处理，即可为低密度海马神经元在盖玻片上的生长提供足够的机械和营养支持。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何在无胶质细胞饲养层的条件下培养超低密度的原代小鼠胚胎海马神经元。希望您能将此方法应用于自身的实验研究中。