小鼠中枢神经系统的被动CLARITY光学透明化处理

本方案的主要目标是展示对原始 CLARITY 方案的改进，以获得更一致且更具成本效益的结果。该方法有助于回答神经科学中的关键问题，例如中枢神经系统中的三维形态和连接性。该技术的主要优势在于提高了小鼠中枢神经系统中光学透明化和显微成像的一致性。

以经济高效且可重复的方式进行。该方法的可视化演示至关重要，因为成像室的构建过程较为复杂，仅通过文字描述难以清晰呈现。

获取表达荧光蛋白的小鼠的多聚甲醛固定的脑和脊髓组织。将脑置于塑料小鼠脑切片模具中，沿中线用模具刀片切割，得到半脑。将每个半脑和脊髓分别放入不同的50毫升离心管中。

每管含有 40 毫升水凝胶溶液。用铝箔包裹试管，以保护荧光染料。将含有样品和水凝胶的试管置于 4 摄氏度条件下，轻轻振荡孵育 7 天。

孵育结束后，弃去25毫升水凝胶，保留样品及约25毫升水凝胶于离心管中。随后打开管盖，将离心管放入干燥器罐中，并将干燥器罐连接至真空泵以对样品进行脱氧处理。真空处理至少持续10分钟。

轻轻摇晃以去除释放出的氧气气泡。10分钟后，用100%氮气在两到三分钟内替换干燥器罐中的真空。待压力平衡且干燥器罐盖可以打开后，迅速盖紧试管，防止氧气重新进入。

接下来，将装有样品的离心管置于37摄氏度水浴中三小时，使水凝胶完成聚合。三小时后，聚合完成的水凝胶将呈现凝胶状质地。使用刮铲将聚合后的样品从离心管中取出，然后切除样品周围多余的水凝胶。

最后，将样品置于无尘擦拭纸上，轻轻擦拭并滚动组织，以去除残留的水凝胶，仅在样品上留下一层薄薄的聚合水凝胶。为开始脂质清除过程，将聚合后的样品转移至含有45毫升透明缓冲液的洁净50毫升离心管中，在45摄氏度条件下轻轻振荡孵育七天。在此初始七天期间，每天更换缓冲液，将用过的透明缓冲液倒入化学废液容器中。

加入45毫升新鲜的透明化缓冲液。待所有脂质溶解且组织达到透明后，将样品转移至一个新的50毫升离心管中，管内装有45毫升PBST，在接下来的24小时内于40摄氏度轻轻振荡洗涤四次，以去除残留的SDS。最后一次PBST洗涤后，将样品转移至一个洁净的15毫升离心管中，管内含有1微克/毫升DAPI和1×PBST。

用锡箔纸包裹，并在室温下孵育 24 小时。次日，在室温下用 PBST 洗涤三次，每次洗涤至少六小时。然后进行折射率匹配。

开始此步骤时，将样品转移至一个洁净的15毫升离心管中，管内含有2-2硫代二乙醇和pH 7.5的1×PBS，按屏幕上所示进行孵育。在第二次孵育即将结束时，取一段可重复使用的粘合剂，将其卷成直径均匀的圆柱形，其直径略大于样品厚度。将该圆柱形粘合剂以开口朝外的环形置于一个40毫米玻璃底培养皿上，形成成像腔室。

然后使用 P1000 移液器吸头，沿圆柱体外缘滚动，使可重复使用的粘合剂与玻璃之间形成密封。向玻璃培养皿中加入约 100 µL 的 63% TDE，铺展液体以覆盖粘合剂圈内的玻璃表面。然后使用刮铲小心地将样品置于圆圈中央，注意避免产生气泡。

接下来，用移液器将另外100微升63%TDE直接滴加到样品上，并立即在可重复使用的粘性密封垫上放置一个40毫米的圆形盖玻片。用双手的食指、中指和无名指仔细按压圆周边缘，直到盖玻片与样品接触。然后，将玻璃底培养皿缓慢竖起并靠在平面上，再用移液器加入63%TDE，直至液体上升至顶部的小开口处。

使用无尘布擦干移液枪头，以防止溶液滴落在玻璃上。最后，在小开口处加入硅胶弹性体，封闭圆形区域，形成一个密闭的腔室。静置五分钟使其干燥，然后进行成像。

将装有样品的成像腔室放置在激光扫描共聚焦显微镜的载物台上。打开成像软件，点击程序顶部的“配置”选项卡，然后点击激光图标，以开启氩激发激光。勾选氩激光旁边的复选框以启动激光，并将滑动条调节至30%。返回顶部的“采集”选项卡。

在光路设置框中，进入加载-保存设置框，从下拉菜单中选择适当的波长通道以发射YFP。在通道设置框中，通过单击标有“objective current object”的红色超链接来选择适合成像的物镜。使用工作距离大于组织厚度的物镜。

采用大数值孔径以最大化平面内图像分辨率，并最小化光学切片厚度。在下拉菜单的左列中打开XY分辨率窗口，将采集矩阵（称为格式）设置为1024×1024，或根据物镜的横向分辨率极限选择适当的数值。将缩放因子设置为尽可能低。

此处使用1.7。在同一窗口中，通过分别下拉标有标签的菜单来设置第八行平均和单帧平均参数。使用载物台控制来定位样品。

当观察到具有代表性的视野后，将增益设置为 760 至 780，YFP 的偏移量设置为 1.0 至 1.5。选择拼图扫描，然后设定将要采集的 Z 层栈的上限和下限。

根据物镜的光学切片分辨率极限设置光学切片厚度，然后开始采集。该图像显示了以5倍放大倍数成像并在三维中重建的大脑皮层和海马体中YFP阳性神经元。比例尺代表1毫米。

该脑皮层10倍图像堆栈的最大强度投影展示了皮层第五层锥体神经元的树突分支。此处比例尺代表100微米。此处显示了完整颈段和胸段脊髓中的THY-1YFP表达，以5倍放大倍数成像，并重建为三维图像。

比例尺代表2毫米。最后，这是脊髓10倍成像堆栈的最大强度投影，显示了单个轴突，比例尺代表100微米。如果操作得当，完整脊髓的处理可在2至4周内完成，而半切脑组织则需4至6周。

完成此操作后，可进一步采用其他方法（如免疫组织化学），以回答需要更复杂生化表型分析的问题。观看本视频后，您应能够充分理解如何对小鼠中枢神经系统进行光学透明化处理及成像，具体方法包括被动透明化技术与激光共聚焦显微镜成像。