从慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染小鼠中分离的活化调节性T细胞的表型与功能分析

本实验的总体目标是评估从慢性病毒感染小鼠中分离的调节性T细胞的体外抑制功能。该方法有助于解答关于慢性病毒感染期间活化的调节性T细胞表型及其体外抑制功能的相关问题。该技术可用于评估调节性T细胞对体外T细胞阳性反应个体的直接影响。

该技术具有显著优势。首先，将50微升FACS缓冲液中的5 × 10⁵个总脾淋巴细胞转移至新的U型底96孔板的每个孔中，随后加入150微升FACS缓冲液。离心该板并弃去上清液。

随后重悬细胞沉淀，并用 200 微升 FACS 缓冲液每孔洗涤细胞两次。第二次洗涤后，在每孔中加入 50 微升抗体混合液，于 4 摄氏度避光孵育 20 分钟。然后用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次，并弃去上清液。

接着，在4摄氏度避光条件下，用100微升固定缓冲液固定细胞20分钟，随后用破膜洗涤缓冲液洗涤两次。第二次洗涤后，将细胞重悬于50微升抗-FOXP3抗体中。为制备抗CD3和CD28包被的磁珠，将适量磁珠转移至15毫升离心管中，并加入等体积的PPS。

用移液器轻轻混匀溶液，离心磁珠。洗涤结束后，弃去上清液，每孔用50 µL完全培养基重悬磁珠。接下来，每孔加入50 µL浓度为1×10⁵的CD4阳性CD25阳性调节性T细胞，接种于96孔U型底培养板中，随后每孔加入50 µL浓度为1×10⁵的CD8阳性反应性T细胞。

当所有细胞接种完毕后，向每孔加入 50 微升稀释的抗 CD3 和 CD28 包被磁珠，并加入最多 50 微升培养基，使每孔总体积达到 200 微升。然后用铝箔覆盖培养板，置于 37 摄氏度、二氧化碳培养箱中培养 72 小时。为分析 CD8 阳性 T 细胞的细胞因子产生情况，在培养三天后，将上清液转移至另一块 96 孔板中，并根据试剂盒制造商的说明，通过 ELISA 分析上清液。

为了分析 CD8 阳性 T 细胞的增殖情况，用 FACS 缓冲液将细胞板中的细胞洗涤三次。然后在避光、4 摄氏度条件下，将细胞沉淀重悬于 50 微升针对增殖型 CD8 阳性 T 细胞的适当抗体混合液中，孵育 20 分钟。孵育结束后，用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次，并在避光、4 摄氏度条件下，加入 100 微升固定缓冲液固定 20 分钟。

最后，用FACS缓冲液再洗涤细胞两次，并将沉淀重悬于200 µL FACS缓冲液中。然后通过流式细胞术检测Phycoerythrin（PE）和CFSE双标记的CD8阳性T细胞增殖百分比。在来自未免疫和感染小鼠的脾淋巴细胞中，PD-1在LCMV clone 13感染小鼠的传统FOXP3阴性CD4阳性细胞和FOXP3阴性CD8阳性细胞中均特异性上调。

LCMV clone 13 感染小鼠中 FOXP3 阳性 CD4 阳性调节性 T 细胞的频率是未免疫小鼠的两倍，其中大多数 FOXP3 阳性 CD4 阳性细胞还表现出活化的 PD-1 高表达表型。CD8 阳性应答性 T 细胞可被成功分离，且其他免疫细胞的污染极少。在分离调节性 T 细胞后，可获得纯度超过 80% 的以 CD25 阳性 CD4 阳性 T 细胞为主的细胞群体。

使用抗CD3和CD28包被的磁珠刺激分离的调节性T细胞和反应性T细胞，可剂量依赖性地抑制CD8阳性反应性T细胞。事实上，当CD8阳性反应性T细胞与慢性感染状态的调节性T细胞以1:1的比例共培养时，CD8阳性反应性T细胞的增殖受到显著抑制。与来自未免疫小鼠的静息调节性T细胞共培养相比，当CD8阳性反应性T细胞与来自慢性感染小鼠的活化调节性T细胞共培养时，CD8阳性反应性T细胞产生干扰素γ的能力也显著降低。

我们发现，如果操作得当，该技术可在80小时内完成。在进行此操作时，重要的是要记住，在分离出调节性T细胞后应立即使用新鲜分离的细胞。该技术的发展为医学领域的研究人员探索调节性T细胞在慢性炎症性疾病中的功能铺平了道路。

观看本视频后，您应充分了解如何使用调节性T细胞与反应性T细胞共培养体系建立体外调节性T细胞抑制实验。